细胞破碎技术 (2).ppt

*包涵体获得

几种常见的工艺路线（三）化学破碎（加变性剂）离心除细胞碎片除变性剂复性第63页,共70页，星期六，2024年，5月*用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。路线三：第64页,共70页，星期六，2024年，5月*1）包涵体的洗涤细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。第65页,共70页，星期六，2024年，5月*2）目标蛋白的变性溶解包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。常用变性剂：▲5-8mol/L盐酸胍和6-8mol/L尿素,作用：破坏离子间相互作用；▲表面活性剂如1-2％十二烷基硫酸钠SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。▲PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。第66页,共70页，星期六，2024年，5月*原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。复性方法：稀释法除变性剂－加入大量水或缓冲液。膜分离法除变性剂－透析、超滤、电渗析。层析法：凝胶层析，高效疏水层析3）目标蛋白的复性第67页,共70页，星期六，2024年，5月*蛋白质复性影响因素：变性剂浓度目标蛋白浓度；pH和离子强度；氧化还原条件。还原剂：二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；氧化剂：氧化型谷胱甘肽;碱性下通空气。复性区多聚物生成区絮凝沉淀区盐酸胍浓度mol/L红血球碳酐酶复性操作中变性剂与蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度mol/L第68页,共70页，星期六，2024年，5月*包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）第69页,共70页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第70页,共70页，星期六，2024年，5月*非机械破碎方法酶溶破碎法（enzymelysis）化学破碎法（chemicaltreatment）去垢剂破碎法（detergents）渗透压冲击破碎法（osmoticshock）冻融破碎法（freezingandthawing）第31页,共70页，星期六，2024年，5月*二非机械法非机械方法很多1酶解2化学法溶胞3物理法渗透压冲击冻结和融化干燥法其中酶法和化学法溶胞应用最广。二第32页,共70页，星期六，2024年，5月*1酶解（酶溶法Enymaticlysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等第33页,共70页，星期六，2024年，5月*外加酶法酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。第34页,共70页，星