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QPＣR原理及应用

由于Real－tiｍeqPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被reａl—tｉmeqPCR所代替。由于rｅal—tiｍｅaＰＣR输出的数据不同于常规的PCR电泳检测,很多没有做过reａｌ—timeqPCR的研究者常常感到高深莫测,不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。

本文就从real—timｅqPCR的发展史说起，包括real—timeｑＰCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析,常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-tｉmeqPＣＲ，彻底的从菜鸟到高手!

一、Real—ｔimeqPCR发展史

Real—tiｍeqPＣR就是在ＰCR扩增过程中,通过荧光信号，对ＰＣR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据.由于常规的PCR的缺点,rｅal-timeqPCR由于其操作简便,灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析,ＳNP检测,等位基因的检测,药物开发,临床诊断,转基因研究等.

在Ｒeal—tｉmｅqPCR技术的发展过程中,定量PCR仪的发展起了至关重要的作用.199５年,美国PE公司（已经并入Iｎvitrogen公司)成功研制了Taqmａn技术，1996年推出了首台荧光定量ＰCＲ检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析．从而荧光定量PＣR获得广泛应用。现在的定量PCR仪有AＢI７００0、7300、7５00，77０0、790０ＨT、ＳtepOnｅＰluｓTＭ、ＳｔeｐＯneTM、PRISM@StepOneTＭ系列;BIＯ-ＲAD的CFX9６、iCycleｒiＱ5@、MyiＱ@、ＭJRｅseaｒchＣhｒｏmｏ4TMOpticon系列；SｔratagｅneＭxTM系列;ＲｏcheLightCyｃleｒ@系列;ＥpｐｅnｄｏｒfMａsercycler＠；CorbetｔRotor－GｅｎeＴＭ;ＣｅphｅidSmartCｙcｌｅr@和BIOＥＲ的LｉｎeGeｎe系列．

随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的reａｌ—tｉｍePCＲ仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。二、Rｅal-ｔimeqPCR概述

１.Reａl-timeｑPCＲ原理

实时ＰCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCＲ进程进行实时检测。一般来讲，定量PCR仪包括:实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。

常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LEＤ;荧光检测元件常用两种方式:光电倍增管和冷光CＣD摄像机,光单色元件有滤光片和光栅。在实时ＰCR扩增过程中,荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线,荧光阈值和Ct值.2．Ｒeal-timeqPCR的数学原理

首先来看一个rｅａｌ-ｔimeqＰＣR中的重要参数Ｃｔ值（Ctvalue),阈值(ｔｈreshold),和基线（baseｌiｎｅ)。一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线,是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的１0倍。在实际操作中也可以手动调节,位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。

那么为什么说Ｃt值跟初始模板的量成反比呢?我们来看ＰCＲ的扩增方程：

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从线性方程上看,斜率(slope)为－1/lｇ（1+E),所以E=10－1/ｓlope－1．如果从标准曲线上得到斜率（—3.３），就可以算出扩增效率(0。99）．一般来讲PCＲ扩增效率在90%-11０％都是可以用于数据分析的。效率低于10０%，是由于PCR反应中存在抑制因素;而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。3。Real-tiｍｅｑPCR的种类

根据rｅal-tｉmeqPＣR的化学发光原理可以分为2大类:一类为探针类,包括TaｑMaｎ@探针和分子信标,利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加;一类为非探针类，其中包括如ＳYBR@GreeｎＩ或者特殊设计的引物(如LＵＸ@Pｒｉｍｅｒｓ)