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羊李斯特菌病诊断技术

1范围

本文件规定了羊李斯特菌病的临床诊断、病理学诊断和实验室诊断的技术要求。本文件适用于羊李斯特菌病的诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，凡是注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验

GB19489实验室生物安全通用要求。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

李斯特菌病listeriosis

由李斯特菌引起人和动物的一种重要的人兽共患传染病，呈散发或暴发发生，主要表现为脑膜炎、败血症和怀孕母羊流产。

3.2

李斯特菌溶血素OlisteriolysinO,LLO

单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的主要毒力因子，对真核细胞膜具有裂解活性。

4临床诊断

单核细胞增生李斯特菌引起羊李斯特菌病的临床症状为脑膜脑炎、败血症和流产。发病初期，羊体温升高1℃~2℃,采食、咀嚼、吞咽困难，头颈呈一侧性麻痹，弯向对侧，做转圈运动。角弓反张，昏迷卧于一侧，直至死亡。病程短的2d～3d，长的1至3周或更长时间。妊娠母羊流产，羔羊常发生急性败血症而很快死亡。

伊氏李斯特菌引起羊李斯特菌病的临床症状为胃肠炎、新生羊败血症和怀孕母羊流产，罕见病例呈脑膜脑炎相关的临床表现。

5病理诊断

5.1眼观病变

眼观病变表现如下：

a）神经症状的病羊：脑及脑膜充血、水肿，脑脊液增多，稍浑浊；

b）败血症型的病羊：肝脏呈多灶性坏死，脾脏肿大，心外膜下出血；c）流产母羊：有胎盘炎，子宫内膜和胎盘充血及广泛坏死。

5.2组织病理学变化

血液中白细胞总数升高，单核细胞增多，炎性细胞灶及其邻近的血管周围呈套袖现象，占主导的细胞是淋巴细胞、组织细胞、浆细胞；脑干嗜中性粒细胞液化。

6实验室诊断

6.1细菌学诊断

6.1.1细菌分离和培养

无菌采取病羊的脑脊髓液、脑、肝、脾、心、肺和肾组织，置于放有冰袋的采样箱中（温度低于10℃)于24h之内运回实验室，直接涂片镜检，取样品直接接种到科玛嘉平板上于37℃培养24h，同时按照附录A的方法进行增菌和鉴定；或按照GB4789.30推荐的方法进行增菌，转接到牛津琼脂平板上，放置在37℃培养，培养至24h和48h检查细菌培养情况。

6.1.2菌落形态及革兰氏染色

菌落形态：李斯特菌在脑心浸液平板上培养24h后，形成直径约为1mm～2mm的乳白色菌落，边缘整齐、表面光滑、隆起度高，粘稠、易挑起（附录A中图A.1）。在科玛嘉培养基上形成的菌落呈蓝绿色，菌落周围有白色晕环（见附录A中图A.2）。在含七叶苷的琼脂培养基（如MOX平板）上形成的菌落呈黑色（见附录A中A.3）。

革兰氏染色镜检：革兰氏染色阳性的小杆菌，两端钝圆，排列成“V”型或并列排成栅栏状。

6.1.3生化特性

根据菌落特征选取5个菌落，观察细菌形态及在血琼脂上培养后的溶血活性，测定细菌发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖及水解七叶苷的能力。

单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的生化特征如表1所示。

表1李斯特菌的生化特征

菌种

葡萄糖

麦芽糖

甘露醇

鼠李糖

木糖

七叶苷

β-溶血反应

协同溶血反应

单核细胞增生李斯特菌

+

+

-

+*

-

+

+

**

-

伊氏李斯特菌

+

+

-

-

-

+

+

***

+

*血清型4h的单核细胞增生李斯特菌不能利用鼠李糖

**血清型4h的单核细胞增生李斯特菌协同溶血反应呈阳性

***在划线有马红球菌的血平板上呈铲型溶血（见附录A中图A.4）

6.1.4毒力鉴定

将强毒菌株以1根106CFU腹腔注射小鼠后，小鼠14天内死亡。小鼠脾脏、肝脏、淋巴结、肺脏、肾上腺、心肌、胃肠道中有较小的坏死灶。取心血、肝、脾直接做涂片，镜检出现大量呈“V”型或栅栏状

的革兰氏阳性杆菌。

6.2分子生物学诊断

挑取细菌的菌落作为PCR的模板，用属特异性引物PCR扩增出370bp的条带判定为李斯特菌属；用单核细胞增生李斯特菌特异性引物PCR扩增出660bp的条带判定为单核细胞增生李斯特菌；用伊氏李斯特菌特异性引物PCR扩增出1100bp的条带判定为伊氏李斯特菌（附录B）。

6.3血清学诊断

以李斯特菌溶血素O作为包被抗原、羊血清样品作为第一抗体、酶标兔抗羊IgG作为第二抗体，建立间接ELISA检测的血清学方法，应用于流行病学调