核质分离操作步骤.pdf

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ChromatinFractionation

1.about3x104cellswerewashedwithPBSandresuspendedin200Ul

ofbufferA(10mMHEPES(pH7.9),10mMKCL1.5mMMSCI2,0.34

Msucrose,109%5glycerol,1mMdithiothreitol.0.1%TritonX-100and

proteaseinhibitormixture(RocheMolecularBiochemicals).

2.thecellswereincubatedfor5minonice.

3.Nucleiwerecollectedinthepellet(P1)bylowspeedcentrifugation

(1500xg,4min,4?C).

4.TheSupernatant(S1)wasfurtherclarifiedbyhighspeed

centrifugation(13.000xg，10min，4?C)toremovecelldebrisand

insolubleaggregates.TheSupernatantwasdesignatedS2.

.NucleiwerewashedoncewithbufferAwithout0.1和TritonX-100

andthenlysedin200ulofbufferB(3mMEDTA,0.2mMEGTA,1

mMdithiothreitol,andproteaseinhibitormixture).

6.Aftera10minincubationonice,Solublenuclearproteins(S3)were

separatedfromchromatinbycentrifugation(2000xg,.4min).

7.Isolatedchromatin(P3)waswashedoncewithbufferBandspun

downathighspeed(13.000xg,1min).

8.removesoupandrestorethepellet(P3)in200ulsamplebuffer.

Sample“buffer:6x8mlsample(0.3MTr1mlLGlycerol

1.6ml,10%SDS1.6ml.0.$%Bromphenol0.8ml，p-ME0.4ml.H2O2.0)

该用户很懒，什么也没介绍

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