DNA甲基化检测方法.pptxVIP

;;主要检测途径;基于重亚硫酸盐转化的方法;基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理1;基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理2;用于甲基化分析的样本常常是混合样本，不适合直接直接进行sanger测序分析;图6PMVK基因扩增产物反向测序结果;图7TRIB3基因扩增产物正向测序结果;应用二：

重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequencePCR，BSP)

;注：A：癌组织；B：癌旁组织；○-：未甲基化；●：甲基化;BSP克隆测序甲基化率三维图形;优点:能准确的检测出每个DNA分子单倍体型的

甲基化状态，同时能分析不同CpG位点之间

的甲基化状态的联系。

缺点：需要对PCR产物克隆，操作繁琐，费时费

力，克隆子的数目影响结果的准确性。

测序重复性差。

;应用三：

甲基化特异性PCR(methylafion-specificPCR，MS-PCR)

;UMUMUMladder

;MSP扩增产物凝胶电泳图;优点：

①操作简便；②敏感性高；③Nested-MSP提高灵敏度，便于分析微量检材

缺点：

①引物设计要求高；

②只能作定性研究；

③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性；

④只能了解部分位点的甲基化状态。;对MSP的产物用Taqman探针进行qPCR，从而

实现甲基化的定量分析。;应用四：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA);结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法;甲基化特异性的限制性内切酶(MDRE)：

可以识别甲基化的胞嘧啶;图1-1MSRE-PCR原理图

注：左图DNA无甲基化,DNA被切断,无法得到PCR产物;右图DNA有甲基化,

DNA保持完整,可以获得PCR产物.;;图1-3：DNM基因琼脂糖凝胶电泳图;酶识别位点内含有一个及以上CpG位点;优点：

①方法相对简单；

②可进行甲基化水平的定量研究；

③需要样本量少。;

缺点：

①由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序列的CG将被忽略；

②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义；

④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题；;

应用五：

RestrictionDigestionandReal-TimePCR(qAMP);基本步骤;举例：Theevalutionofdifferentiallymethylatedregion(MDR)

ofimprintedgeneU2af1-rs1,intestisandliverofmouse;LiverandtestisgenomicDNAtemplatesarePCRamplicatedfollowingdigestionwithnoenzyme(sham),Notl,Hhal(Hh)orMcrBc.AmplicationusingasecondprimerpairthathasbeendesignedtoasequencedevoidOfrestrictionsitesdemonstratesthatthetemplatesareofequalconcentration.;ThedifferenceintheCtvalueofanenzyme-digestedtemplate

relativetothesham-digestedtemplatedeterminatesthelevels

ofDNAmethylationineachtissue.;启动子区甲基化芯片技术;;PrimerExtensionMethods;;;质谱法检测的优势：

;;1;

;

HRM技术：

用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点鉴定感兴趣的CpG岛。;

HRM技术原理;HRM技术原理;

HRM特点;应用十二：焦磷酸测序法;焦磷酸测序法（Pyrosequencing）;焦磷酸测序法（Pyrosequencing）;焦磷酸测序;焦磷酸测序;焦磷酸测序;

焦磷酸测序的优势：

灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域。

除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化。

对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人类基因组的所有CpG位点；

对于样