基本蛋白质实验.pptVIP

几种根本蛋白质实验技术;SDS

Westernblotting

Southwesternblotting

Immunochemistry;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;1.制备凝胶试剂：

丙烯酰胺〔单体〕

亚甲双丙烯酰胺〔胶联剂〕

二者比例29：1

母液浓度30%

过硫酸铵〔引发剂〕

N,N,N,’N’-四甲基乙二胺〔TEMED〕(加速剂)

十二烷基磺酸钠〔SDS〕〔阴离子变性剂〕;2.蛋白上样缓冲液

3.电泳缓冲液?(pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液)

4.考马斯亮蓝R250染色液

5.脱色液;SDS实验过程流程如下：

凝胶制备

蛋白样品制备及上样

电泳

卸胶

染色

脱色;;;分子量范围与凝胶浓度;12%SDS凝胶成分〔15ml〕;5%SDS凝胶成分〔6ml〕;蛋白样品制备及上样;电泳;卸胶:防止凝胶破损

染色:考马斯亮蓝染色

考马斯亮蓝R2501.25g，甲醇225ml，冰醋酸

50ml，MilliQ水定容500ml。

脱色:甲醇150ml，冰醋酸50ml，MilliQ水300ml。

;;Westernblotting;Westernblotting实验过程流程如下：;电场转移;凝胶;SDS-蛋白质复合物在电场的作用下向正极移动，到达NCM，以共价键结合在NCM上。

根据目的蛋白分子量大小设定电流〔恒流〕或电压〔恒压〕大小。;电转移操作时应注意：;转移完成后，可用0.5%丽春红(0.5g丽春红1ml冰醋酸100ml水)染NCM,观察转移的效果；同时，转膜后的凝胶也可以进行银染或者考染，评价转移的效果。

最好是NCM上可见，凝胶上模糊。

;;;免疫化学染色;免疫化学染色过程:;二抗孵育将辣根过氧化物酶二抗用封闭液稀释后,将硝酸纤维素膜参加其中,室温摇床上放置2小时；

洗涤TBST充分3~4次,10min/次；

DAB显色将二抗孵育后的硝酸纤维素膜放入显色液中,轻轻摇动3~10min,待膜上可见明显的显色斑点。

;;Southwesternblotting;Southwesternblotting实验过程流程如下：;Immunochemistry

;;

组织固定、石蜡包埋、切片、脱蜡

过氧化氢灭活内源性过氧化物酶

微波修复抗原

封闭

一抗、二抗孵育孵育

DAB显色

苏木素—伊红〔HE〕复染;Keypoints;

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