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第二节补体结合试验

补体结合试验〔complementfixationtest，cft〕是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反响系统抗原或抗体的试验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反响。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。

一、类型及原理

自身免疫性溶血，如果有补体参与时，补体通过一系列的激活，最后形成膜攻击复合物〔membraneattackcomplex〕，它可以直接攻击红细胞膜，导致红细胞破裂，这就是所谓“血管内溶血”。而没有补体参与的免疫性溶血，抗体与红细胞膜上抗原结合后，没有直接把红细胞破坏，而是把红细胞“致敏”，致敏RBC在通过脾脏等网状内皮系统时，被吞噬细胞“吃掉”，这就是所谓“血管外溶血”。

该试验中有5种成分参与反响，分属于3个系统：①反响系统，即的抗原〔或抗体〕与待测的抗体〔或抗原〕；②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反响系统与指示系统争夺补体系统，先参加反响系统给其以优先结合补体的时机。

如果反响系统中存在待测的抗体〔或抗原〕，那么抗原抗体发生反响后可结合补体；再参加指示系统时，由于反响液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反响系统中不存在的待检的抗体〔或抗原〕，那么在液体中仍有游离的补体存在，当参加指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性〔图14-2〕。因此补体结合试验可用抗原来检测相应抗体，或用抗体来检测相应抗原。

图14-2补体结合试验示意图

二、试验方法

补体结合试验的改进方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法〔塑板法〕等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下表达以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。

〔一〕试剂

1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反响。

2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反响〔100％不溶血〕的最高稀释度作为抗原和抗体的效价〔单价〕。滴定方法举例如表14-4。在试管中参加不同稀释度的抗原，配加不同稀释度的抗血清，另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。按照试验方法加补体和指示系统，温育后观察结果。在表14-4中可见1:64抗原和1:32抗体各作为1个单位。在正式试验中，抗原一般采用2～4个单位〔1:64～1:32〕，抗体采用4个单位〔1:8〕。

表14-4抗原和抗体的方阵滴定

抗原

抗血清稀释倍数

抗原对照

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

1:512

1:4

4

4

4

4

4

4

3

2

0

1:8

4

4

4

4

4

3

2

1

0

1:16

4

4

4

4

3

2

2

±

0

1:32

4

4

4

4

3

1

±

0

0

1:64

4

4

4

④

2

±

0

0

0

1:128

4

2

1

0

0

0

0

0

0

1:256

3

1

0

0

0

0

0

0

0

1:512

0

0

0

0

0

0

0

0

0

抗体对照

0

0

0

0

0

0

0

0

?

注：1、2、3、4分别表示溶血反响强度＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋；0为不溶血。

3．补体滴定按表14-5逐步参加各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，确定为1个实用单位，正式试验中使用2个实用单位。如形14-5中的结果为1:60的补体0.12ml可产生完全溶血，按比例公式0.12×2:60＝0.2:x计算，x＝50；即实际应用中的2个补体实用单位应为1:50稀释的补体0.2ml。

表14-5补体的滴定

管号

1:60补体〔ml〕

缓冲液〔ml〕

稀释抗原〔ml〕

?

致敏srbc

〔ml〕

?

结果

1

0.04

0.26

0.1

放

置

37℃水

浴30min

0.2

放

置

37℃水

浴30min

不溶血

2

0.06

0.24

0.1

0.2

不溶血

3

0.08

0.22

0.1

0.2

微溶血

4

0.10

0.20

0.1

0.2

微溶血

5

0.12

0.18

0.1

0.2

全溶血

6

0.14

0.16

0.1

0.2

全溶血

〔二〕血清标本

采集血液标本后及时别离血清，及时检验或将血清保存于－20℃。血清在试验前应先加热56℃30min〔