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虾肝肠胞虫检测荧光定量PCR法

1范围

本文件描述了虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测法的试剂与材料、仪器设备、操作方法及结果判定。本文件适用于虾肝肠胞虫的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范

3试剂与材料

3.1一般要求

本标准所用试剂如无特殊说明均为分析纯试剂；试验用水应符合GB/T6682一级水的要求。

3.2引物与TaqMan-MGB探针

上游引物EHP-qF、下游引物EHP-qR、TaqMan-MGB探针EHP-qP根据表1给出的寡核苷酸序列人工合成，扩增66bp的目的片段。使用浓度均为10μmol/L。使用前按本标准要求先用灭菌DEPC水稀释，稀释后分装成小量置于-20℃保存备用，避免反复冻融。

表1特异性引物及探针寡核苷酸序列及扩增的目的片段大小

引物/探针

序列（5′--3′）

扩增产物（bp）

EHP-qF

CGCGGTAATTCCAACTCCAA

66

EHP-qR

TCTACGACTACGGACCCTTTAACTG

EHP-qP

FAM-AGTGTCTATGGTGGATGCT-MGB

3.3DNA抽提试剂

3.3.1商品化DNA抽提试剂盒。

3.3.2异丙醇。

3.3.3无水乙醇。

3.4荧光定量PCR试剂

3.4.12×PremixExTaq?(ProbeqPCR)。

3.4.2ROXReferenceDyeⅡ或ROXReferenceDye：参考仪器使用说明，用以校正孔间荧光信号误差。

3.4.3工作标准品为pMD18-T-SSUEHP：可委托生物公司制备，使用浓度为1.0×104拷贝/μL～1.0×107拷贝/μL。

3.4.4阳性对照为已知EHP阳性的对虾组织，-80℃保存。

3.4.5阴性对照为已知EHP阴性的对虾组织，-80℃保存。

3.4.6空白对照以无菌双蒸水为模板。

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4仪器设备及耗材

4.1仪器设备

4.1.1定量PCR仪。

4.1.2高压灭菌锅。

4.1.3组织匀浆机。

4.1.4普通冰箱：具冷藏箱，可达到-18℃以下冷冻箱体。

4.1.5超低温冷藏设备：可达到–80℃。

4.1.6水浴锅或金属浴。

4.1.7台式高速离心机：最高转速可达12000r/min以上。

4.1.8旋涡振荡器。

4.1.9微量离心机。

4.1.10微量移液器。

4.2耗材

4.2.1微量移液器枪头。

4.2.21.5mL微量离心管：经高压蒸汽灭菌，一次性使用。

4.2.3灭菌0.2mLPCR管：经高压蒸汽灭菌，一次性使用。

4.2.4塑料或乳胶手套：一次性使用。

5操作方法

5.1采样

样品采集按SC/T7103的规定执行。

5.2样品前处理

虾样按不同规格取不同组织。其中，受精卵、幼体、仔虾采集整条虾作为样品，3cm以下幼虾采集除虾眼外整条虾作为样品，3cm以上虾采集鳃、肝胰腺作为样品。采集的样品用组织匀浆机匀浆，立即进行DNA提取操作或–80℃超低温冰箱保存。

5.3阳性对照样品和阴性对照样品的处理

阳性对照样品和阴性对照样品的采集和取样分别按6.1和6.2进行，将采集的虾组织样品匀浆后小量（30mg）分装于1.5mL离心管后置于-80℃超低温冰箱保存备用。每次检测前各取出1管阳性对照和阴性对照样品，与待检样品进行下面的操作。

5.4DNA的提取

取5.2中30mg样品，按照商品化动物组织基因组DNA快速提取试剂盒说明书提取总DNA，最后加60μL洗脱缓冲液溶解DNA，置于-20℃保存备用。

5.5荧光定量PCR

采用50μL反应体系。在荧光定量PCR管中依次加入灭菌DEPC水10.5μL，2×PremixExTaq?(ProbeqPCR)25μL，ROXReferenceDyeⅡ0.5μL，上游引物EHP-qF、下游引物EHP-qR、探针EHP-qP各3μL，模板5μL。加完试剂后瞬时离心，将PCR反应管置于定量PCR扩增仪内，按下面反应程序进行反应：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸45s，扩增40个循环；在60℃结束时收集荧光信号。

6结果判定

6.1