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西番莲种苗病毒检测技术规程

1范围

本文件规定了西番莲（Passiflorasp.）种苗病毒检测的术语和定义、检测对象、质量要求、抽样方法、检测方法和判定规则。

本文件适用于海南西番莲生产及种苗调运过程中的病毒检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T401脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程

NY/T3179甘蔗脱毒种苗检测技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

无特定病毒原种

通过茎尖组培等脱毒技术获得的、或经检测确认未受本文件规定的检测对象侵染的西番莲种苗。3.2

采穗母株

用无病毒原种作种苗，在防虫网室、温室等严格隔离条件下保存或扩繁，专门为生产西番莲种苗提供嫁接接穗和扦插枝条的西番莲植株。

4检测对象

西番莲的无病毒原种、采穗母株和商品种苗必需检测马铃薯Y病毒属（Potyvirus）。该病毒属的常见病毒如东亚西番莲病毒（EAPV）、夜来香花叶病毒（TeMV）可根据需要选择检测。

5质量要求

西番莲种苗生产中目测检查和病毒检测应符合表1和表2的规定。

表1目测检查质量要求

项目

允许率a（%）

无特定病毒原种

采穗母株

商品苗

疑似病毒病症状（花叶、畸形等）

0

2.0

5.0

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项目

允许率a（%）

a表示有疑似病毒症状样品数占检查样品总数的百分比。

表2病毒检测质量要求

项目

允许率a（%）

无特定病毒原种

采穗母株

商品苗

马铃薯Y病毒属（Potyvirus）

0

0

5.0

a表示阳性样品数占检测样品总数的百分比。

6抽样方法

6.1无特定病毒原种

每株必检，每3个月进行病毒检测1次，出现症状或检测为阳性的植株立即拔除并进行无害化处理。

6.2采穗母株

每半年病毒检测1次，每株一年内至少被抽检1次，出现症状或检测为阳性的植株立即拔除并进行无害化处理。

6.3商品苗

同一批生产批次或同一调运批次的种苗为同一检验批。采用随机抽样方法,按同一检验批不小于0.5%的比例抽样，最低抽样数量为20株。

7检测方法

7.1目测检查法

在苗圃生产及调运条件下，先采用目测方式检查疑似病毒病症状。西番莲病毒毒常见症状可参考附录A。

7.2试纸条检测法

商品苗的现场快速检测，宜用马铃薯Y病毒属的市售检测试纸条进行检测。按产品说明操作。

7.3酶联免疫吸附测定（ELISA）法

检测样品数量较多时，宜用马铃薯Y病毒属的通用抗血清进行ELISA检测。按NY/T401的附录A规定执行。

7.4逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法

需更高精度检测、或需对其它检测方法检测结果进行复核时，宜用马铃薯Y病毒属通用引物进行RT-PCR检测，其中上游引物：5’-GCWKCHATGATYGARGCHTGGG-3’，下游引物：5’-AYYTGYTYMTCHCCATCCATC-3’，退火温度45℃,目标片段：680bp。按NY/T3179的附录C规定执行。

8判定规则

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8.1检测试验可靠性判定

用已知含目标病毒的西番莲样品或含目标病毒扩增片段的质粒做阳性对照；用已知不含目标病毒的西番莲样品或不含目标病毒扩增片段的质料做阴性对照；用等体积的无菌ddH2O替代样品做空白对照。只有在阳性对照、阴性对照和空白对照的检测结果均正常时，方可说明检测试验可靠，其结果可用于对被检样品进行检验判定。

8.2样品检测结果判定

ELISA检测法中被检样品与阴性对照之间的OD405值比值≥2，样品检测结果判定为阳性。

试纸条检测法中被检样品试纸条近液端和远液端同时出现2条反应线，样品检测结果判定为阳性。RT-PCR检测法，被检样品电泳泳道出现与目标大小一致的电泳条带，样品检测结果判定为阳性。

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附录A

（资料性附录）

西番莲常见病毒病症状

A.1花叶

指由于形状不规则的深绿、浅绿、黄绿而形成的不规则杂色，不同颜色部位的轮廓是清楚的叶片。见图1。

、

图1花叶症状

A.2斑驳

指由于形状不规则的深绿、浅绿、黄绿而形成的不规则杂色，但变色部位的轮廓不很清楚的症状。

见图2。

图2斑驳症状

A.3畸形

指植物整株或局部的形态异常。全株性生长不正常的畸形，常见的有矮化和矮缩，叶片的畸形主要