现代分子生物学第六章习题参考答案.doc

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现代分子生物学第六章习题参考答案

1、列举两种研究基因表达模式的方法并简述原理。

答：=1\*GB2⑴基因表达系列分析技术：它是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。

=2\*GB2⑵基因定点突变技术：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。

3、简述基因芯片技术对分子生物学研究的意义。

答：基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（SouthernBlotting和NorthernBlotting等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。

4、比较酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术在研究蛋白质相互作用方面的优缺点。

答：=1\*GB2⑴酵母双杂交技术

优势：1、大规模筛选；2、操作简单，直观（可以用荧光做报告基因，也可以用氨基酸缺陷型平板筛选等）

缺点：1、传统的酵母双杂交技术不能研究膜蛋白的相互作用，由此派生出的新技术研究膜蛋白的相互作用较困难；2、酵母双杂交技术研究的目的蛋白相互作用需在酵母细胞核内发生相互作用，那么新的问题产生了：如果酵母双杂交技术显示两个蛋白相互作用（也就是在酵母细胞核内，这两个蛋白确实相互作用），但是两个相互作用蛋白在原宿主内却位于不同细胞器（也就是他们不可能出现在同一个位置），那么假阳性就产生了，由此出现的例子很多。

=2\*GB2⑵免疫共沉淀技术(Co-IP)

优势：该技术能捕捉到发生在染色质水平上的基因表达调控的瞬时事件，如实、完整地反映DNA与蛋白质的动态结合；

缺点：难以同时得到多个因子对同一序列结合的信息，或目标蛋白不是直接地与染色质结合等。

7、列举三种研究DNA和蛋白质相互作用的方法，并比较其优缺点。

答：=1\*GB2⑴电流迁移率变动分析（EMSA）：又称凝胶阻滞实验，是一种简单、快速和极为灵敏的体外检测DNA与蛋白质相互作用的技术，它可实现对目的蛋白的定性和定量分析。

优缺点：传统的EMSA分析通常采用放射性同位素标记的寡核苷酸探针，该方法虽灵敏性高、特异性强，但因同位素的半衰期短，且易于污染环境、危害身体等因素，在一般的实验室无法进行，其应用的广泛性受到了极大的限制。目前，人们已采用了地高辛和生物素标记的寡核苷酸来代替传统的放射性同位素标记的寡核苷酸，并在EMSA试验中获得成功。同时基于ENSA的基础上发展了超迁移率变动分析和毛细管凝胶阻滞电泳，前者特异性要比EMSA好，常用于鉴定其他方法筛选出来的结果；后者样品用量少、分辨率高，可用于一些受限制比较大的DNA一蛋白质互作分析，如胚胎发育的研究过程。

=2\*GB2⑵酵母单杂交技术：该技术通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴定DNA顺式作用元件和转录因子的结合情况；通过筛选DNA文库，来获得与靶序列特异结合的蛋白质基因序列。

优缺点：该系统相对直接、快捷、灵敏，筛选到的蛋白是在体内相对天然条件下有结合功能的蛋白质，比其他体外技术获得的结果更能体现真核内基因表达调控的真实情况，且无需复杂的蛋白质分离纯化操作。但因细胞技术的先天局限性和所用报告基因His3或lacZ的自泄漏表达等缺陷。在实际操作中常出现漏检和假阳性现象。

=3\*GB2⑶免疫沉淀法(ChIP)：其原理是在活细胞状态下利用甲醛或其他交联剂固定蛋白质一DNA复合物，经超声破碎、特异性抗体沉淀复合体，后解除偶联、纯化目的片段并检测等步骤来获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

优缺点：ChIP能捕捉到发生在染色质水平上的基因表达调控的瞬时事件，如实、完整地反映DNA与蛋白质的动态结合，但该方法尚存些不足，如：难以同时得到多个因子对同一序列结合的信息，或目标蛋白不是直接地与染色质结合等。