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原位杂交

原位准备工作：

1、不锈钢与玻璃器皿180度烘12小时以上

2、需DEPC处理的三蒸水约8升（听说可以用灭菌三蒸水代替）

3、双蒸水可以用一馏水（即蒸馏水）代替

4、所用枪头可以灭一个小时烘干用（也可用烘好的移液管）

5、所用蜡片温度不能过高，防止材料变形

6、切片一定要尽量吸干，并且烘12小时以上（但不能过长），以防脱落

7、实验所需试剂的量要略作变动，大缸约600ml，小缸约500ml

8、所有试剂除储备液外，最好都现配现用，请备好足够的烘好的量筒及容器

最后强调杂交之前配试剂、融蜡与加蜡所用一切器皿器具都要180度处理，请戴乳胶手套（尽量避免接触其它地方）以防组织RNA降解

下次做需买的东西：

1、tRNA（一个100u的加50ul水，较粘稠吸取时应慢些，并看一下是否吸到）

2、BSA（一次约需15克）

3、多聚甲醛（一次约需20克）

4、非去离子甲酰胺（一次约需200多ml）

5、RNAse（实验室可能有）

6、最好领2个2L的三角瓶

7、乳胶手套

8、无水乙醇（一次约需12瓶，有些地方应该可以95%的代替）

做之前请认真检查所需一切用品是否到位

I．组织固定和包埋

在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料，似乎比4%多聚甲醛固定时抽气更彻底。

FAA固定液（400ml），室温保存：

无水乙醇200ml

冰醋酸20ml

37%甲醛40ml

水（DEPC）140ml

1L水加1mlDEPC，37℃过夜（最好一直慢摇或剧烈摇晃后再放入）

第一天：组织固定（下午4、5点取材）

将装有2/3体积固定液的青霉素小瓶（小瓶预先在180℃烘过）置于冰上，取新鲜材料投入，冰上真空抽气。缓慢抽气冒气泡后保持真空15分钟后缓慢放气，如此数次至材料沉底即可，以达到快速彻底固定。换新鲜固定液，4℃过夜（12～16小时）。（用DEPC-H

第二天：脱水

?

Solution

?

?

time

?

numberofchanges

50%ethanol

?

60minutes

one

60%ethanol

?

60minutes

one

*70%ethanol

?

60minutes

one

以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇

*组织可在70%ethanol4℃

第三天：进一步脱水和浸蜡

以下所有步骤在4℃

Solution

time

numberofchanges

85%ethanol

60minutes

one

95%ethanol

60minutes

one

以下所有步骤在室温进行并不时轻摇

Solution

time

numberofchanges

100%ethanol

?

30minutes

two

100%ethanol

?

60minutes

two

25%二甲苯,75%ethanol

?

30minutes

one

50%二甲苯,50%ethanol

?

30minutes

one

75%二甲苯,25%ethanol+番红

?

30minutes

one

100%二甲苯

?

60minutes

two

100%二甲苯+1/4volumeParaplastPlus(paraffin)chips

overnight

(不要摇动)

?

准备工作：60℃

第四天：浸蜡

将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60

第五天：浸蜡

换蜡两次（ParaplastPlus）sigmaP3683-1kg

第六天：浸蜡

换蜡两次（ParaplastPlus）

第七天：浸蜡

换蜡两次（ParaplastPlus）

准备工作：60℃

第八天：包埋

此步对得到理想的组织切片有很大影响，详细步骤和注意事项参见石蜡切片protocol。最后包有材料的蜡块置4℃

修块修得小一些，一张片子上可多放些切片，包埋时空得开一些，每个小苗单独分开。

切片前把镊子，解剖针都烧一下灭菌，烧好后放在一张干净的铝箔上。

切9微米，一张片子放三个样，先切好一个放在kimwipe纸上，三个都切好后一个个镜检，选好区域（在镜检的玻片背面划三道线，方便寻找）

三条带都准备好后，将一张新玻片放在烤片机上，加1ml左右DEPC-H2O盖平，放入蜡片，用kimwipe纸吸去水，使蜡带在一起，先大致吸去水后再竖直玻片将水吸尽。

II．切片

将新的载玻片置于预热至42℃（若动作较慢可40度，防止温度过高蜡带融化）的烤片机上，