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两种氨基糖苷抗生素(庆大霉素和链霉素)抗体制备研究

黄秋明陈旭彦

1.材料与方法

1.1主要材料

1.1.1试剂

注射用庆大霉素（购于华农大校医院）

动物用链霉素（购于华农大兽药厂）

牛血清白蛋白（BSA）

卵血清蛋白（OVA）

弗氏完全佐剂（FCA）

弗氏不完全佐剂（FIA）

酶标羊抗小鼠

N′N－二甲基甲酰胺（DMF）

25%戊二醇、95%乙醇

30％双氧水(HO)

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马血清

脱脂奶粉

乙酸乙酯、NHS（N-酰基琥珀酰亚胺）、EDC（碳二亚胺）、丁二酸酐、硼氢化钠、MES、

二氯甲烷、考马斯亮蓝、HPO、三乙胺

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1.1.2主要仪器

各种规格移液枪

恒温磁力搅拌器

4℃和－20℃冰箱

酶标仪

紫外分光光度计

电子天平

恒温水浴箱

冷冻离心机

旋转蒸发仪

1.1.3其它材料

透析袋（新透析袋的处理：用蒸馏水煮沸10min，冷却至室温即可使用）

96孔酶标板

一次性注射器（1ml）

离心管

剪刀、镊子

1.1.4ELISA各种试剂的配制

（1）．包被液（0.1M、PH9.6碳酸盐缓冲溶液）：将0.636gNaCO和1.172gNaHCO加到

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200ml蒸馏水中，装入试剂瓶中4℃保存备用。

（2）．PBS贮存液（PH7.4，20倍）：4gKHPO,58gNaHPO•12HO,4gKCl,定容到1000ml，

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室温贮存。

（3）．PBST洗涤液（0.01M、PH7.4）：取上述配备的PBS贮存液100ml，加入17gNaCl，

再加入1900ml蒸馏水，加入1mlTween－20，混匀，室温贮存，长期贮存期间出现浑浊，

不能用，另配。

（4）．稀释液：取100mlPBST洗涤液，加入0.1g明胶溶解，明胶比较难溶解，37℃水裕

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放置1小时，过滤即可，4℃下保存（一个星期内有效）。

（5）．底物缓冲液（PH5.0）：0.933g柠檬酸，3.689gNaHPO•12HO，定容到200ml，4℃

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贮存（1个月内有效）。

（6）．底物贮存液（发黄不可用）：80mg邻笨二胺溶于10ml底物缓冲液中，分装贮存（0.5ml/

支），怕光，操作快速，-20℃贮存。

（7）．显色液：临用前现配，取0.5ml底物贮存液壁光快速解冻，加入9.5ml底物缓冲液，

再加入16μl30％过氧化氢（HO），立即用，用后剩余的丢弃。

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（8）．终止液（10％硫酸）：取10ml浓硫酸，加入到90ml蒸馏水中，室温贮存。

（9）．封闭液：2％的马血清/5g脱脂奶粉+100mlPBS+0.8gNaCl

1.2实验内容

1.2.1抗原的合成

（1）庆大霉素人工抗原：

方法一（EDC法）：称取10mgBSA（免疫原载体）或OVA（包被抗原载体）溶于1ml蒸馏

水中，然后加入32mg（0.8ml）庆大霉素得混合溶液A。称取EDC315mg溶于1ml蒸馏

水中，得溶液B，最后将A、B混合，在室温下用磁力搅拌机轻柔搅拌3h后，将反应

物取出，在透析袋中用0.9％的生理盐水透析3天，每天换透析液3次。透析好的反应

物分装后，保存于-20℃冰箱中。

方法二（GDA法）：

1NHS丁二酸酯的制备：

5gNHS+4.35g丁二酸酐30ml二氯甲烷