蛋白质相互作用.pptVIP

蛋白质相互作用研究方法蛋白质之间相互作用研究的重要性后基因组时代(post-genomicera)在细胞中通常与其他蛋白质相互作用形成大的复合体，在特定的时间和空间内完成特定的功能，而且有些蛋白质的功能只有在复合体形成后才能发挥出来，如依赖于构象变化或翻译后修饰的蛋白质功能StelzlU,etal.Cell,2005,122(6):957~968GavinAC,etal.Nature,2002,415(6868):141~147RainJC,etal.Theprotein-proteininteractionmapofHelicobacterpylori.Nature,2001,409(6817):211~215GiotL,etal.AproteininteractionmapofDrosophilamelanogaster.Science,2003,302(5651):1727~1736LiSM,etal.AmapoftheinteractomenetworkofthemetazoanC.elegans.Science,2004,303(5657):540~543内容蛋白质与蛋白质之间相互作用蛋白质与核酸之间相互作用蛋白质与药物分子之间相互作用1GST融合蛋白进行Pull-down

（1）原理细菌表达的谷胱甘肽s-转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，可以采用GST融合蛋白Pull-down。该方法只是用于确定体外相互作用。两种应用：1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用方法：1）GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a,单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c,体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应（4oC2h）3）离心弃上清4）沉淀加入2×蛋白LoadingBuffer煮沸，离心5）取上清进行SDS电泳，6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做WesternBlot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白该实验设立GST对照，反应均在4oC进行利用westernblot确定捕获蛋白实验注意事项（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（np40或tritonx-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用(3)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(4)要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；优点相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；如用westernblot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。TheTwo-HybridSystemTwohybridproteinsaregeneratedwithtranscriptionfactordomainsBothfusionsareexpressedinayeastcellthatcarriesareportergenewhoseexpressionisunderthecontrolofbindingsitesfortheDNA-bindingdomainInteractionofbaitandpreyproteinslocalizes