(黄巧韵)科技创新项目论文.pdf

科技创新项目

对虾白斑病毒VP28基因克隆及质粒构建与表达

02220023702082002370216

黄巧韵刘健萍生命科学学院级生物技术班

摘要

对虾白斑综合症是由白斑病毒（WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV）引起的，该病

毒为专性甲壳类动物寄生，其发病特点为传染快、治愈率地、死亡率高。因此一旦发生

往往造成极大的经济损失，甚至对虾类养殖业造成毁灭性打击。该病毒首先在台湾发现，

然后在全球对虾养殖水域都有发生。目前该病在全球范围暴发流行，而且还没有有效的

预防和治疗方法。本项目旨在利用基因工程技术的PCR方法体外扩增WSSV的VP28囊

膜蛋白基因，然后插入到pET32质粒中，将带有VP28编码基因的重组质粒转入表达菌

中诱导其表达，之后通过微生物发酵技术大量生产VP28囊膜蛋白。收集并纯化WSSV

的VP28，作为一种添加剂（或者称之为口服疫苗）添加到虾饲料中，使对虾在采食该饲

料后获得对WSSV的免疫能力。本科技创新项目主要是进行VP28编码基因的克隆、质

粒构建、转入到大肠杆菌BL21表达菌并进行发酵工艺的研究。

关键词：对虾白斑病毒VP28囊膜蛋白PCR扩增诱导表达IPTGSDS电泳

1前言

对虾白斑综合症是由白斑病毒（WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV）引起的，该病

毒为专性甲壳类动物寄生，其发病特点为传染快、治愈率地、死亡率高。因此一旦发生

往往造成极大的经济损失，甚至对虾类养殖业造成毁灭性打击。目前该病在全球范围暴

发流行，而且还没有有效的预防和治疗方法。WSSV已成为养殖对虾的主要病原，也是

目前发现的基因组最大的动物病毒(基因组约290kD，双链环状)。其典型症状是对虾甲壳

内侧出现0.52mm大小不等的白色斑点，真皮易于剥离，对虾体色微红，摄食减少，静

卧池底，体质虚弱，胃肠空虚，腹节肌肉略白等，整个虾池病程一般310天。该病毒首

先在台湾发现，然后在全球对虾养殖水域都有发生。它不仅能感染对虾，还能感染其他

淡水及海水甲壳类，如螃蟹、鳌虾等。养殖对虾被感染后，3～10d内累积死亡率可达

100%，给某些地区的对虾养殖业造成毁灭性打击。

近十几年来，国内外对WSSV病毒的形态结构、基因组全序列、宿主范围、传播途

径、致病性和组织细胞特异性等作了大量的研究。近年来更多的人着重于研究该病毒的

防治方法。

目前对虾白斑综合症的防治方法主要有：培育无病虾种、改善养殖环境、提高对虾

自身体质、利用药物防治等。但这些方法都只是通过改变环境条件来预防，没有利用虾

本身内在免疫系统对疾病的抵抗能力。最近研究报道证明甲壳类动物有获得性免疫反应，

并且有记忆特性。这一发现推翻了长期以来人们一直认为的甲壳类动物是没有获得性免

疫功能的观念，即它们不能通过外界抗原刺激产生免疫反应和免疫记忆。不久前，有人

通过已灭活的病毒或重组蛋白质作为刺激因子，以口服或浸泡的方法引导它们产生获得

性免疫。人们称之为“类免疫反应”。

人们已经知道，WSSV囊膜蛋白包括VP19和VP28，并已确定VP28与病毒的侵染

性有关。有关研究分别用VP19和VP28囊膜蛋白制成口服疫苗进行攻毒，对比之下，

VP28的效果更明显。

最近国内外表达WSSV囊膜蛋白的方法主要在目的基因载体和表达菌两方面各有差

异。有人用pUC19作为载体，也有用噬菌体作为载体的；而表达菌方面有人用蓝细菌，

也有用大肠肝菌DH5等。

本项目旨在利用基因工程技术的PCR方法体外扩增WSSV的VP28囊膜蛋白基因，

然后插入到pET32质粒中，将带有VP28编码基因的重组质粒转入表达菌中诱导其表达，

2

之后通过微生物发酵技术大量生产VP28囊膜蛋白。收集并纯化WSSV的VP28，作为一

种添加剂（或者称之为口服疫苗）添加到虾饲料中，使对虾在采食该饲料后获得对WSSV

的免疫能力。本科技创新项目主要是进行VP28编码基因的克隆、质粒构建、转入到大

肠杆菌BL21表达菌并进行发酵工艺的研究。

2材料与方法

1.PCR体外扩增：

①建立PCR体系，预设条件如下：