分子生物学课件-(共56张PPT).pptx

分子生物学课件;基因操作(genemanipulation)

基因工程(geneengineering)

遗传工程

genecloning

molecularcloning

基因操作的核心部分为重组DNA技术。

RecombinationDNAtechnology

;基因工程与建筑工程;DNARecombination;理论上三大发现：

Avery肺炎双球菌转化实验：

证实了遗传物质的本质是DNA（1944年）

Watson和Crick：

提出DNA双螺旋结构模型（1953年）

Nirenberg等：

确定了遗传信息的传递方向（1961-1966年）

DNARNA蛋白质;技术上三大发明：

工具酶：分子手术刀，切割与缝合基因，包括限制性内切核酸酶、连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，对DNA或RNA进行各种各样的修饰。

载体(vector,vehicle)：本意是媒介体，在基因工程上指能将目的基因导入宿主细胞的DNA分子。

逆转录酶（reversetranscription,RT)：打破了中心法则，使真核基因制备成为可能，RT-PCR。

RNADNA;genemanipulation过程;;重组DNA技术的意义;组织纤溶酶原激活物（tissueplasminogenactivator，tPA）;

;基因操作的工具酶;1、限制性内切酶;命名：3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号

第1字母（大写）产生该酶细菌的属名的第一字母；第2、3字母（小写）细菌的种名；

第4字母（大写）细菌菌株名；

罗马数字代表该菌株中发现的第几个酶。

EcoRI:Escherichiacoli????R(大肠杆菌R株);限制与修饰（Restriction-modification）;分类;5‘-3’DNA聚合活性

3、目的基因与载体连接，构建重组DNA分子；

多克隆位点（MultipleCloningSite）

5‘-3’DNA聚合酶活性

3、目的基因与载体连接，构建重组DNA分子；

定义：是一类能够识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。

质粒拷贝数(plasmidcopynumbers)：

严紧型质粒(stringentplasmid)：在寄主细胞内的复制除了受本身复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少。

35KD76KD

应用甲基化处理保护免受限制性内切酶降解

Nirenberg等：

在?噬菌体颗粒内，基因组DNA呈线性，其两端的5‘末端带有12个碱基的互补单链（cos粘性末端），

切割的方式有平切和交错切。

SevereCombinedImmunodeficiency,

5‘-3’DNA聚合活性

真核表达载体：酵母，哺乳??物，昆虫细胞表达载体;是基因工程中最常用的酶，

该类酶的分子量小，专一性强,

切割的方式有平切和交错切。;Ⅱ类限制性内切核酸酶;粘性末端（cohesiveend）--在DNA双链的不同位置切割DNA，形成有单链突出的末端。

平末端（Bluntend）--在DNA双链的相同位置切割DNA分子。

;常用的限制性内切酶;DNA连接酶（ligase）;23;DNA聚合酶;DNA5’…ATGACTG…3’

3’…TACTGAC…5’

RNA5’…AUGACUG…3’

转录：以S.SDNA为模板，在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下….

逆转录：….依赖RNA的DNA聚合酶…;DNA聚合酶与DNA复制;常用的DNA聚合酶：

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ；

E.coliDNApolymeraseⅠ的Klenow片段（Klenow酶）；

耐热DNA聚合酶；

反转录酶

;DNA聚合酶;大肠杆菌DNA聚合酶I的酶活性

5‘-3’DNA聚合活性

3‘-5’外切酶活性

5‘-3’外切酶活性

Klenow片段的酶活性

5‘-3’DNA聚合酶活性

3‘-5’外切酶活性;主要用途:;克隆（clone）：n,无性繁殖系及其后代。

genemanipulation过程

基因工程(geneengineering)

用来区别重组质粒与非重组质粒。

Nirenberg等：

是一类耐热的DNA聚合酶。

Example:pBR322质粒

RNADNA

依赖RNA的DNA聚合酶…

严紧型质粒(stringentplasmid)：在寄主细胞内的复制除了受本身复制机构的控制