DB41T 1587-2018 饲料中大肠杆菌O157的检测 EMA-PCR法.pdfVIP

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B46

DB41

河南省地方标准

DB41/T1587—2018

饲料中大肠杆菌O157的检测EMA-PCR法

2018-04-17发布2018-07-17实施

河南省质量技术监督局发布

DB41/T1587—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由河南省畜牧局提出并归口。

本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、郑州大学。

本标准主要起草人：方忠意、高延玲、李金磊、赵全成、陈小鸽、孟伟、魏法山。

本标准参加起草人：董鹏、狄元冉、陈蔷、张艳娜、赵林萍、曾萍、张宁、王庆东、郑彬、李博、

彭丽、张磊。

I

DB41/T1587—2018

饲料中大肠杆菌O157的检测EMA-PCR法

1范围

本标准规定了饲料中大肠杆菌O157的EMA-PCR检测方法。

本标准适用于饲料中大肠杆菌O157的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.6食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T14699.1饲料采样

3原理

叠氮溴化乙锭（EMA）能够透过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使

死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增。

4试剂和材料

4.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682一级水的要求。

4.2营养肉汤：见附录A的A.1。

4.3肠道增菌肉汤：见附录A的A.2。

4.42×Premix2+

Taq缓冲液：内含TaqDNA聚合酶1.25U/25μL，4mmolMg，dNTP各0.4mmol。

4.5特异性引物(对)序列为：

a）上游引物：5＇-CAGGTGAAGGTGGAATGGTTGT-3;

b）下游引物：5＇-CTCTTTCCTCTGCGGTCCTAGTTA-3＇。

4.6琼脂糖：电泳级。

4.7Marker2000。

4.8大肠杆菌O157CICC21530。

4.950×TAE缓冲液：见附录A的A.3。

4.106×上样缓冲液：见附录A的A.4。

4.11叠氮溴化乙锭（EMA，0.2mg/mL）：见附录A的A.5。

4.12溴化乙锭（10mg/mL）。

4.13灭菌离心管：1.5mL，15mL。

5仪器设备

1

DB41/T1587—2018

5.1PCR仪。

5.2电子天平：感量0.01g。

5.3电热恒温培养箱。

5.4离心机：转速≥12000r/min。

5.5浊度仪。

5.6卤素灯：照度≥25000勒克斯（Lux）。

5.7核酸电泳仪。

5.8凝胶成像系统。

5.9微量移液