《识别胶原蛋白三螺旋结构抗体的制备方法》.docVIP

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ICS11.040.30

CCSC30

团体标准

T/****XXXX-2024

识别胶原蛋白三螺旋结构抗体的制备方法

Preparationmethodofidentifyingcollagentriplehelixstructureantibody

征求意见稿

20XX-XX-XX发布20XX-XX-XX实施

深圳市质量检验协会???发布

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由深圳市质量检验协会提出。

本文件由深圳市质量检验协会标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心）、深圳粒影生物科技有限公司。

本文件主要起草人：王书晗、葛建敬、张小燕、王尔一、林楚楚、纪元、刘尧

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引言

随着生物医学研究的深入发展，具有三螺旋结构的胶原蛋白作为一种重要的结构蛋白，在疾病诊断、治疗以及组织工程等领域展现出了广阔的应用前景。然而，目前市场上针对胶原蛋白三螺旋结构的抗体质量参差不齐，制备方法缺乏统一标准，这给相关研究和应用带来了诸多不便。

为了规范识别胶原蛋白三螺旋结构抗体的制备方法，提高抗体质量和应用效果，制定了本文件。本文件旨在明确抗体制备过程中的各项要求，以确保制备出的抗体具有良好的特异性和亲和力。

识别胶原蛋白三螺旋结构抗体的制备方法

1范围

本文件规范识别胶原蛋白三螺旋结构的抗体的制备方法，提高抗体质量和应用效果。

本文件适用于重组人胶原蛋白三螺旋结构的鉴别。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有修改单）适用于本文件。

GB/T16886系列标准

GB/T19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

3.1具有三螺旋结构的胶原蛋白collagenwithatriplehelixstructure

由三条α肽链通过氢键相互连接形成的右手超螺旋状结构，这种结构使得胶原蛋白具有更优良的生物力学性能和稳定性。

3.2抗体antibody

由浆细胞产生的能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。

4.试剂及其配制

4.1试剂和对照品

a）HAT培养基

b)预染的蛋白分子量标准

c)封闭液

d)一抗和二抗

e)化学发光试剂

4.2溶液配制

a)ELISA包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6）

b)终止液：量取10ml98%浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml,室温保存。

c)显色液：A液：精确称取3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）20mg溶于10ml无水乙醇中，待完全溶解后，用双蒸水稀释至100ml；B液：将Na2HPO4·12H2O14.34克和柠檬酸1.87克溶于180毫升双蒸水中，加入1.28毫升0.75%过氧化氢尿素，定容至200ml，并调节pH至5.0-5.4。将A液和B液按1：l混合后即成TMB显色液。

d)洗涤液：量取500mlTween20加入到1升PBS溶液。

e）50%PEG4000溶液：称取50gPEG4000用ddH2O定容至100ml，121℃灭菌15min，室温保存。

f)HEP-ES缓冲液：称取23.8gHEPES，87.6gNaCl，8.7gEDTA和0.5mlTween20加适量的纯水溶解搅拌，调pH到7.4后定容到1L，0.22μm滤膜过滤

g)甘氨酸再生缓冲液：7.5g甘氨酸加纯水溶解后，调pH到3.0后定容到1L，0.22μm滤膜过滤

注：以上试剂也可用市售成品

5仪器和设备

a)酶标仪

b)垂直电泳仪及电源

c）脱色摇床

d）转膜仪

f）凝胶成像仪

g）Biocare8K

6试验步骤

6.1具备三螺旋结构胶原蛋白抗原的设计

可选择动物源性天然提取的具有三螺旋结构的胶原蛋白，也可以根据胶原蛋白三螺旋结构的特点，设计重组胶原蛋白序列，最终抗原经过圆二色谱鉴定其具有三螺旋结构YY/T1849-2022。圆二色谱的实时升降温测试显示热稳定性大于37℃，且体外加速稳定性实验可维持3个月以上。

6.2动物免疫

按照附录B进行试验并提取脾脏淋巴细胞。

6.3制备抗体

按附录C进行试验时，将免疫后的B淋