碱性磷酸酶的活力测定.ppt

3、铁氰化钾的硼酸溶液称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。4、酚标准工作液（0.05mg/ml）：购买合格的二级标准品。4一氨基安替比林用量与吸光度成正相关，需准确加入。铁氰化钾用量不足时，反应不完全，测量结果偏低，因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量本实验采用终止法；终止剂是铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了PH，使其不再处于最适PH。第32页,共41页，星期六，2024年，5月肆实验操作·第33页,共41页，星期六，2024年，5月立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。保持反应时温度是均衡的，37°C取试管4支，按下表操作实验过程两次水浴保温，一次5min，一次15min。前者是达到最适温度，后者是反应时间第34页,共41页，星期六，2024年，5月ADDYOURTITLEHERE12单击此处编辑您要的内容，建议您在展示时采用微软雅黑字体，本模版所有图形线条及其相应素材均可自由编辑、改色、替换。更多使用说明和作品请详阅模版最末的使用手册。单击编辑标题单击此处可编辑内容，根据您的需要自由拉伸文本框大小单击此处可编辑内容，根据您的需要自由拉伸文本框大小【注意事项】1、铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。2、底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色，说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。3、加入铁氰化钾后必须迅速混匀(为了改变PH来终止酶促反应）否则对实验结果有影响，偏大。4、一般血清标本可以共用对照管，黄疸血清及溶血血清应分别作对照管5、目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久置第35页,共41页，星期六，2024年，5月计算ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白）*0.05*100(金氏单位）金氏单位定义每100ml血清在37℃与底物作用15分钟，产生1mg酚为1个金氏单位。参考值成人：3~13金氏单位儿童：5~28金氏单位第36页,共41页，星期六，2024年，5月临床意义：血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。1．血清ALP活性升高可能原因如下：①肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；②骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。2．血清ALP活性降低比较少见：主要见于呆小病、重症慢性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。另有一种遗传性低ALP症，因成骨细胞中缺乏ALP，引起骨中的矿物质严重缺乏，易发生骨折。第37页,共41页，星期六，2024年，5月标准曲线法加入物（ml)012345酚标准应用液1ml=0.1mg00.050.10.20.30.4蒸馏水3.13.053.02.92.82.7碳酸盐缓冲液1.01.01.01.01.01.00.5%铁氰化钾溶液2.02.02.02.02.02.0相当于金氏单位00.510203040第38页,共41页，星期六，2024年，5月磷酸对硝基酚连续监测法以磷酸对硝基酚为底物，2-氨基-2-甲基-l-丙醇或二乙醇胺为磷酸酰基的受体。在碱性环境下，ALP催化无色磷酸对硝基酚水解产生游离的对硝基酚，对硝基酚在碱性溶液中转变成黄色。根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位，反应需要Mg2+作为激活剂。立即混匀，选择波长510nm，用零号管调零，读取各管吸光度，然后将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。。第39页,共41页，星期六，2024年，5月磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际单位；受胆红素和溶血的干扰。但是若用磷酸对硝基酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。实验小结第40页,共41页，星期六，2024年，5月*感谢大家观看第41页,共41页，星期六，2024年，5月关于碱性磷酸酶的活力测定问题1：为何要测定血清中酶的活性？有什么意义？第2页,共41页