多管发酵测定总大肠菌群实验指导书.docx

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多管发酵测定总大肠菌群实验指导书

1、目的

1.1了解大肠菌群分解糖类产酸产气的生理特性；

1.2掌握水中总大肠菌群的测定方法；

1.3了解总大肠菌群作为卫生指标的意义。

2、原理

大肠菌群是一群能发酵乳糖，并产酸产气的好氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌的统称，它们主要包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等的细菌。它可反映水体是否有肠道致病菌污染的可能性，并可以作为评价水处理效果、水输配系统清洁度和完整性的指示菌。

多管发酵总大肠菌群的检验方法可适用于饮用水、水源水、污水等各种水样，但操作较繁锁，需要时间较长。

3、测定方法说明

本次实验的方法参考生活饮用水标准检验方法微生物指标（GB/T5750﹒12—2006）及水和废水监测分析方法【第四版（增补版）】编制的。

4、培养基与试剂

4.1乳糖蛋白胨培养基

4.1.1成分

①蛋白胨10g

②牛肉膏3g

③乳糖5g

④氯化钠5g

⑤溴甲酚紫乙醇溶液（16g/L）1mL

⑥蒸馏水1000mL

4.1.2制法

按配方分别称取蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.4。再加入1mL溴甲酚紫乙醇溶液（1.6g/L），充分混匀后分装于有小倒管的试管内，每管10mL。68.95kPa（115℃,101b）高压灭菌20min，取出置于冷暗处备用。

4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基

按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制（蒸馏水除外），分装于有小倒管的试管内，每管5mL。68.95kPa（115℃,101b）高压灭菌20min，取出置于冷暗处备用。

4.3伊红美兰培养基

4.3.1成分

①蛋白胨10g

②乳糖10g

③磷酸氢二钾2g

④琼脂20g～30g

⑤蒸馏水1000mL

⑥伊红水溶液（20g/L）20mL

⑦美蓝水溶液（5g/L）13mL

4.3.2制法

先将琼脂加入900mL蒸馏水中加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨及乳糖，混匀使之溶解，加蒸馏水补足至1000mL，调整pH为7.2～7.4，混匀后定量分装于试管内，68.95kPa（115℃,101b）高压灭菌20min。冷至50℃～55℃，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾倒培养皿。

4.4试剂

草酸铵结晶紫路哥尔氏碘液95%乙醇番红染液二甲苯

香柏油

5、仪器

5.1培养箱：37℃±1℃

5.2显微镜

5.3培养皿

5.4试管

5.6刻度吸管：5mL、10mL

5.7小倒管

5.8锥形瓶：250mL、500mL

5.9试管架

6、实验步骤

6.1初步发酵实验

6.1.1

分别吸取10mL水样加入到装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5支试管中（内有倒管）；另取10mL水样加入到90mL无菌水中，混匀后分别吸取10mL（即1mL水样），加入到装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5支试管中（内有倒管）；再取10mL1︰10稀释的水样加入到90mL无菌水中，混匀后分别吸取10mL（即0.1mL水样），加入到装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5支试管中（内有倒管）。共15支试管，三个稀释度，每递增稀释一次，换用一支10mL灭菌刻度吸管。

6.1.2

检验的水样如污染严重时，应加大稀释度，可接种1,0.1,0.01mL甚至0.1,0.01,0.001mL水样，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。

6.1.3

将接种水样的15支试管置37℃±1℃恒温培养箱中，培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气不产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。

序号

样品名称

接种水量（mL）

初发酵阳性管数

10

1

0.1

10

1

0.1

6.2分离培养

将经初发酵后产酸产气或只产酸不产气的发酵管取出，以无菌操作分别转种到伊红美蓝培养基平板上，置于37℃±1℃恒温箱内培养18～24h，观察菌落特征，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实