酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体方法的建立.pptVIP

“”“”酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体方法的建立李金泽，郑欣宁，杨芳芳，郑思涵2015年11月9日一、何为伤寒伤寒是由伤寒杆菌引起的急性肠道传染病。伤寒是一种古老的传染病，但在目前的传染病防治中，仍占有重要的地位。我国的中医学书刊中所称的“伤寒”，指许多热性疾病，在中医学属于“湿温”病范畴，与现代医学的伤寒与副伤寒，具有不同的含义。伤寒是一种全身性的疾病，并非只局限于肠道受损。伤寒的基本病理特征是持续的菌血症与毒血症，单核吞噬细胞系统的增生性反应，以回肠下段淋巴组织为主的增生、肿胀、坏死与溃疡形成等病变为显著。伤寒是由伤寒杆菌引起的急性传染病，终年可发病，以夏秋季为多。对沙门菌进行快速检测，及早发现传染源，切断传播途径，是最有效地防治沙门菌病的手段。一直以来，伤寒的实验室诊断方法主要靠细菌培养和肥达氏反应。前者的阳性率受病人应用抗生素的影响,而后者在病程的后期才出现阳性,且敏感性较低。这两种检测方法繁琐,需要时间较长,难以达到早期、快速诊断目的。为寻求敏感而特异的伤寒杆菌抗体检测法,我们建立了ELISA试验,检测伤寒病人血清中O抗体,我们采用购买的的伤寒沙门氏菌O抗原免疫家兔，抽取家兔血，经分离与粗纯化，得到粗纯化的伤寒沙门菌O抗体，建立检测伤寒沙门氏菌O抗体的ELISA竞争法,并对伤寒沙门氏菌O抗体进行了检测。二、伤寒的检测三、ELISA实验原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接的放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。竞争法竞争法(ComperingELISA)可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于因相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下：①将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体，洗涤、封板；②待测管中加受枪标本与一定量酶标抗原的混合溶液，使之与因相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。这样，受捡标本中抗原量越高，则由于这些抗原与固相抗体的结合，竞争性的占去了晦标抗原与固相抗体结合的机会，使酶标抗原与固相抗体的结合量越少。参考管中只加酶标抗原。孵育后，酶体抗原与固相抗体的结合可达最充分的量、洗涤。③加庇物显色。参考管中由于结合的酶标抗原量最多，故颜色最深。参考音颜色深度与待测管颜色深度之差．代表受检标本巾抗原的量。待测管颜色越淡．表示标本中抗原量越多。酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体材料与方法一、抗体的制备采用颗粒性抗原（伤寒O抗原）免疫家兔。周数日期操作第一周第一天（2015.9.7）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.1ml第二天（2015.9.8）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.2ml第三天（2015.9.9）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.2ml第四天（2015.9.10）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.5ml第二周第一天（2015.9.14）两侧背部皮下注射伤寒O菌液各0.5ml第三周第一天（2015.9.21）耳缘静脉采血至少20ml二、抗体的鉴定直接凝集试验3周后由已免疫兔的耳缘静脉采血0.5ml，37℃，2500r/min离心30min，取血清。取洁净试管10支，编号，将血清做1:10稀释。混匀后，37℃孵育2~4小时，观察结果。管号12345678910生理盐水0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5稀释血清0.50.50.50.50.50.50.50.50.50伤寒菌液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5终稀释浓度1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120—弃取分离好的免疫血清一份（5ml），加入一份生理盐水（5ml）。缓慢摇动，加入两份饱和硫酸铵溶液（10ml），室温静置1.5h。2000r/min离心20min，吸弃上清。用适量生理盐水（1~2ml）溶解沉淀，放置于透析袋中