电镜样品的基本制备技术之负染色技术.ppt

二、微波辐射快速制样技术的基本程序采用国产蚬华牌家用微波炉，其功率为550W，该炉设有P1—P1０共10个火力段。（—）取材取新鲜材料，按超薄切片法将样品块修成lmm3。（二）固定将样品浸泡于25％戊二醛中，并放入微波炉，在P1火力段下辐射15秒钟作前固定；继用磷酸缓冲液清洗样品3次，每次8分钟；再用1％锇酸浸泡样品，并放入微波炉中，在P1火力段下15秒钟，作后回定。第32页,共38页，星期六，2024年，5月（三）脱水将样品从微波炉中取出，在室温下静放60秒钟，经磷酸缓冲液清洗3次（每次3～5分钟），用50～100％系列丙酮逐级脱水，每级脱水均在Pl火力段下辐射1～2分钟。（四）浸透先将样品放入环氧丙烷中，在室温下浸泡10分钟，而后依次投入环氧丙烷与环氧树脂1：l和l：2混合液中，在P4火力段下2分钟；而后将样品浸泡于纯环氧树脂中，在P4火力段下3分钟。第33页,共38页，星期六，2024年，5月（五）包埋将样品放于配制好的包埋液中，并于周边放一盛有300ml水的烧杯，在P1火力段下30分钟；而后再移去周边的烧杯，继续在P1火力段下辐射30分钟。（六）切片、染色的操作步骤与超薄切片法相同。第34页,共38页，星期六，2024年，5月三、微波辐射制样技术注意事项（—）严格控制辐射温度微波辐射时固定液的温度应控制在40～50℃之间为宜，否则易引起微波损伤；脱水时的温度宜在20℃左右条件下进行。为了知道微波炉各功率段下各种溶液的不同温度，最好在实验前测得。第35页,共38页，星期六，2024年，5月（二）严格掌握辐射功率制样过程中每一步骤所使用的功率（火力段）不尽相同，但总的说应以小功率辐射为主；而且在需要长时间辐射时（如脱水、聚合和包埋），最好采用低功率、间断辐射的方式，这样才能够保存好组织的超微结构。第36页,共38页，星期六，2024年，5月（三）在每步微波辐射之后，最好让样品在药液中停留一段时间，以保证药液渗入样品并与组织充分结合。（四）微波炉的厂家及型号不同，其功率大小和火力段的功率分配亦不相同，故实验时应根据所选用的微波炉来确定每一步骤所用的火力段与辐射时间。第37页,共38页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第38页,共38页，星期六，2024年，5月关于电镜样品的基本制备技术之负染色技术负染色又称阴性反差染色，它是利用高密度的、且在透射电镜下又显示结构的重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正染色相反，其样品结构为透明浅色，而背底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的机制，目前还不够清楚。第2页,共38页，星期六，2024年，5月负染色技术首先，由Ha11（1955）、Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生物学研究中得到了越来越广泛的应用。负染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术相比，该技术具有操作简便、用药量极少、省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及分离的细胞器等研究工作。第3页,共38页，星期六，2024年，5月特别是在病毒学领域，负染色更能发挥其独到作用，是一项很重要的实验技术。第4页,共38页，星期六，2024年，5月—、负染样品的制备负染色所用的样品，全部取自悬浮液。在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度和纯度，这样才能与染色剂之间产生特异和清晰的结合反应。操作时，将带有样品的悬液，滴于带有支持膜的铜网上，染色处理后即可进行电镜观察。其全部制备过程分述于下。第5页,共38页，星期六，2024年，5月（—）浓缩取样法适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。１．红细胞吸附法主要用于粘液病毒和副粘液病毒的制备。其操作方法为：将病毒悬液与等量红细胞混合，放置5分钟，使病毒吸附于红细胞表面；第6页,共38页，星期六，2024年，5月而后，以800转／分速度低速离心15分钟，使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底；最后，弃去上清液，加入少量生理盐水，于室温下或冰箱中存放3～4小时，病毒即可从红细胞表面释放到上面的溶液里，取溶液滴在铜网载膜上，进行后染色处理。第7页,共38页，星期六，2024年，5月2．低渗释放法从培养瓶中刮下所培养的腺病毒或疱疹病