补体C3与BPI活性区融合蛋白(CB)的构建与表达 .pdfVIP

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中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（６）：３１—３７

补体Ｃ３与ＢＰＩ活性区融合蛋白（ＣＢ）

的构建与表达

甘慧周勇王全立詹林盛ｈ

（１军事医学科学院野战输血研究所北京１００８５０２军事医学科学院附属医院输血科北京１０００７１）

摘要补体Ｃ３和杀菌通透性增加蛋白（ＢＰＩ）对血液中的病原体均有黏附、促吞噬甚至杀灭作用，

但两者的作用机制不同，制备两者活性区融合蛋白，可能具有更好的清除血液病原的作用。通过

重叠延伸ＰＣＲ融合人补体Ｃ３的补体受体Ｉ、Ⅲ两个结合区，同时调取了杀茵通透性增加蛋白

（ＢＰＩ）活性区段ｒＢＰＩ，先后将补体Ｃ３活性区与ＢＰＩ蛋白功能区基因克隆入原核表达载体ｐＥＴ２８ａ

中，获得融合蛋白（ＣＢ）表达载体ｐＥＴ２８－ＣＢ，在大肠杆菌中进行了高表达产量、可溶性表达等条件

的摸索，ＣＢ融合蛋白主要以包涵体形式表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明ＣＢ具有Ｃ３的抗原活性，将包涵

体蛋白变性与复性后，利用Ｎｉ２＋固相化的螯合ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ亲和层析柱进行浓缩和纯化，

最后得到了纯度较高的ＣＢ原核表达蛋白，纯化的ＣＢ具备Ｃ３抗原性。ＣＢ融合蛋白的构建和高

效表达、纯化，为下步探讨其在促进血液病原清除上的功能鉴定和应用奠定了基础。

关键词补体Ｃ３杀茵通透性增加蛋白原核表达包涵体

中圈分类号ＱＳｌ６

人血清补体ｃ３成分是补体系统的核心，ｃ３分子活性区，获得Ｃ３一ＢＰＩ活性区融合蛋白（即ＣＢ融合蛋

通过其上的一系列受体位点，与病原体、血细胞、细胞白），构建ｃＢ原核表达载体ｐＥＴ２８－ＣＢ，在大肠杆菌中

间质分子等发生广泛的作用【ｌ・２ｌ。尤其Ｃ３上与红细进行表达和蛋白的提取，并初步验证ＣＢ蛋白活性，为

胞补体Ｉ型受体（ＣＲ１，ＣＤ３５）Ｌ３］、单核细胞和巨噬细其功能和应用奠定基础。

胞补体Ⅲ型受体（ＣＲ３，ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）的结合位点，其

１材料和方法

以桥梁作用介导了病原体的黏附、杀伤以及体内免疫

复合物的清除Ｌ４Ｊ。杀菌通透性增加蛋白（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ—１．１材料

ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＰＩ）是人中性粒细胞中１．１．１质粒和菌株大肠杆菌菌株ＤＨ５ａ、ＢＬ２１菌，

分离到的一种阳离子蛋白，分子量约５５ｋＤａ。大量实验表达载体ｐＥＴ２８ａ，含人ｃ３补体受体Ｉ、Ⅲ结合位点基

室及临床前研究表明，ＢＰＩ具有强大的中和脂多糖和杀因片段的质粒ｐＥＧＸ—ｒＣ３Ａ、ｐＱＥ３０一ｒＣ３Ｂ为本室保存；

灭Ｇ钿菌的能力，最近发现ＢＰＩ还具有抑制血管生成，质粒ｐＣ－ＢＰＩ为军事医学科学院流行病研究所徐俊杰博

抗真菌如抗荚膜组织包浆菌，抗原虫的作用［５ｌ，ＢＰＩ蛋士惠赠。

白由４５６个氨基酸组成，Ｎ端约２００个氨基酸具有蛋白１．１．２工具酶和主要试剂限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连

的几乎全部生物活性Ｌ６Ｊ。将ｃ３活性位点基因片段与接酶、高保真ＴａｑＤＮＡ聚合酶均购自大连宝生物工程

ＢＰＩ蛋白功能区基因融合，获得重组蛋白ＣＢ，以期其具有限公司。蛋白纯化树脂Ｎｉ－ＮＴＡ为Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司产

有一定杀菌活性的同时，还可以作为桥梁分子促进外品。鼠抗一Ｈｉｓ多克隆抗体购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司；ＨＲＰ一羊

源病原被血细胞、巨噬细胞等黏附和吞噬。抗鼠ＩｇＧ、ＨＲＰ卑抗人ｃ３购自北京中山生物技术有限

本实验通过融合Ｃ３分子补体受体结合位点与ＢＰＩ