基因工程与分子生物学常用技术课件.ppt

(二)核酸分子杂交的基本方法Southern印迹杂交(1)指将经酶切和电泳分离的待测DNA片段转印到固相支持物上，然后与标记的DNA探针杂交。(2)可用于分子克隆、遗传病诊断、法医鉴定、肿瘤研究和器官移植等方面。2.Northern印迹杂交(1)指将经电泳分离后的待测RNA片段转印到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交。(2)主要用于检测各种基因转录产物，主要是mRNA。第二十三页，本课件共有34页第二十四页，本课件共有34页关于基因工程与分子生物学常用技术第一页，本课件共有34页第一节基因工程与基因重组(GeneticEngineeringandGeneticrecombination)一、基因工程的基本概念不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的DNA分子，称为DNA重组。将基因进行克隆，并表达制备特定的产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程。第二页，本课件共有34页(一)工具酶1.限制性核酸内切酶(1)能够切割DNA中磷酸二酯键的酶称核酸酶，其中有选择地切割DNA分子特异序列的核酸酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制性内切酶。(2)命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶(3)识别特征5′???GAATTC???3′3′???CTTAAG???5′限制性内切酶识别的DNA序列具有回文结构特征。第三页，本课件共有34页不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种不同的情况：①产生3′突出粘性末端：以EcoRⅠ为例：5′???G↓AATTC???3′5′???GAATTC???3′3′???CTTAA↑G???5′3′???CTTAAG???5′②产生5′突出粘性末端：以PstⅠ为例：5′???CTGCA↓G???3′5′???CTGCAG???3′3′???G↑ACGTC???5′3′???GACGTC???5′③产生平末端：NruⅠ为例：5′???TCG↓CGA???3′5′???TCGCGA???3′3′???AGC↑GCT???5′3′???AGCGCT???5′(4)切割位点第四页，本课件共有34页2.DNA聚合酶(1)基因工程主要应用E.coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶等。(2)主要用途：①利用5/→3/聚合活性，合成DNA第二条链；②对DNA的3/端进行填补或末端标记；③E.coliDNA-polⅠ用于缺口平移，制作探针；④T4DNA聚合酶可用于DNA序列测定；⑤TaqDNA聚合酶用于聚合酶链式反应(PCR)。3.DNA连接酶使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。第五页，本课件共有34页4.逆转录酶(1)用于真核mRNA逆转录，构建cDNA文库。(2)用于进行3/端填补和标记，制备DNA探针。(3)用于DNA序列测定。5.多核苷酸激酶(1)用于放射性标记DNA链的5/端。(2)用于缺少5/-磷酸基的DNA磷酸化。6.碱性磷酸酶此酶防止载体的自身连接。7.末端脱氧核苷酸转移酶能催化单核苷酸转移到DNA的3/-端羟基上。第六页，本课件共有34页(二)载体1.为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，称为载体。2.载体的选择标准能自主复制。易进入宿主细胞。具有多克隆位点。易从宿主细胞中分离纯化。有易被识别和筛选的标志。质粒噬菌体粘粒病毒3.常用载体第七页，本课件共有34页①质粒是细菌中独立于染色质以外的、能自主复制的、并与细菌或细胞共存的遗传成分，可赋予宿主细胞某些遗传性状。②通常质粒的大小为2～300kb。③一般只能容纳10kb的外源DNA片断。(1)质粒(plasmid)第八页，本课件共有34页(2)噬菌体(bacteriophage，phage)①噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。②噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组D