抗原抗体反应的类型之荧光免疫技术（免疫学检验技术课件）.pptx

荧光及荧光物质

荧光及荧光物质内容1荧光的概念指某些荧光物质在吸收一定波长激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其在极短时间内恢复至基态时发射出波长大于激发光波长的光。

01现有两束光，波长分别是490nm和520nm，它们一束是用于激发荧光物质A的激发光，一束是荧光物质A发出的荧光，到底哪一束是激发光？哪一束是荧光呢？490nm520nm提问

荧光及荧光物质内容2Stokes位移Stokes位移=λ发射光-λ激发光发射光波长与激发光波长之差。

02荧光寿命长？荧光寿命短？寿命长寿命短提问

荧光及荧光物质内容3-1荧光寿命指荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。激发光消失，荧光现象消失清晰模糊

荧光及荧光物质内容3-2荧光淬灭荧光物质在某些理化因素（紫外线、高温、苯胺、碘液、硝基苯和酚等）作用下，发射荧光减弱甚至消退的现象。紫外线高温苯胺碘液硝基苯酚

荧光及荧光物质内容4-1发射光谱固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光谱图。检测波长：最大发射峰

荧光及荧光物质固定检测发射光波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的荧光谱图。激发波长：最大吸收峰内容4-2激发光谱

荧光及荧光物质内容4-3荧光效率荧光物质分子将吸收的光能转变成荧光的百分率。吸收光的光量子数（激发光强度）荧光效率=发射荧光的光量子数（荧光强度）

荧光色素镧系螯合物：Eu3+等，时间分辨荧光免疫测定荧光底物其它荧光物质荧光色素最大吸收光谱（nm）最大发射光谱（nm）发光颜色异硫氰酸荧光素（FITC）490-495520-530黄绿色四乙基罗丹明（RB200）570595-600橘红色四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）550620橙红色藻红蛋白（PE）488575红色藻红蛋白-德州红（ECD）488620橘红色藻红蛋白-青花苷5（PeCy5）488670红色藻红蛋白-青花苷7（PeCy7）488755深红色别藻青蛋白（APC）633670红色碘化丙啶（PI）488620橙红色内容5荧光物质类型

荧光及荧光物质FITC（异硫氰酸荧光素）TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）

两张荧光图片均取自荧光显微镜观察的图像，为什么与普通光学显微镜的白色视野不同，荧光显微镜观察的视野是黑色的呢？提问

荧光抗体的制备

荧光抗体的制备荧光抗体的制备（以将FITC共价标记在抗体上为例）1、制备（1）搅拌法（标记体积大、蛋白含量高的Ab）1）杯中加入待标记纯化IgG抗体溶液；2）打开磁力搅拌器，轻轻搅拌，以不起沫为准；3）10-15min内逐滴加入一定量FITC溶液；4）置于4℃搅拌6-12小时。

荧光抗体的制备荧光抗体的制备（以将FITC共价标记在抗体上为例）1、制备（1）搅拌法优点：速度快、FITC用量少。缺点：非特异性荧光染色。动画：荧光抗体制备（搅拌法）

提问荧光抗体的制备假如正常情况下一个抗体上标一个FITC，现在搅拌下一个抗体上标了4个FITC，在试验时会影响结果吗？

荧光抗体的制备荧光抗体的制备（以将FITC共价标记在抗体上为例）1、制备（2）透析法（标记体积小、蛋白含量低的抗体）1）在透析袋中装入碳酸盐缓冲液稀释后的1%IgG溶液；2）配置10倍体积于1%蛋白液的0.1mg/ml的FTIC，置于烧杯中；3）将透析袋置于烧杯中，FITC可进入透析袋，标记抗体；（Ab大分子，不能出透析袋）4）置于4℃，24小时。（结合缓慢、温和，非特异荧光染色少）

荧光抗体的制备荧光抗体的制备（以将FITC共价标记在抗体上为例）1、制备（2）透析法优点：标记均匀。缺点：FITC用量大。动画：荧光抗体制备（透析法）

荧光抗体的制备荧光抗体的制备（以将FITC共价标记在抗体上为例）2、纯化1）去除游离荧光素及降解产物→透析、凝胶过滤2）去除未结合和结合过度的荧光素Ab→阴离子交换层析法3）去除交叉反应或非期望抗体→动物肝粉吸收或固相抗原吸收

荧光抗体的制备荧光抗体的制备（以将FITC共价标记在抗体上为例）3、鉴定Ab效价、F/P结合率等4、保存加入0.1%NaN3或0.01%硫柳汞防腐，避免反复冻融，小袋分装，真空干燥保存。

荧光免疫分析技术

荧光免疫分析技术荧光免疫分析技术类型（1）时间分辨荧光免疫测定（2）荧光偏振免疫测定

时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定基本原理（1）标记物：Eu3+（长荧光物质）（2）基本思路：短寿命非特异性荧光消失后检查长寿命特异性荧光1）非特异性荧光（背景荧光）各种组织、蛋白或其他化合物在激发光照射下都能发出一定波长的荧光（短寿命：1-20ns）2）特异性荧光