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Kallikrein-8促进内皮细胞间质转化在糖尿病心脏和肾脏间质

纤维化中的作用及其机制研究

组织激肽释放酶相关肽酶(tissuekallikrein-relatedpeptidases,KLKs)

是一类具有胰蛋白酶和糜蛋白酶样活性的丝氨酸蛋白酶家族,KLKs可特异性地

裂解低分子量激肽原以形成激肽,后者通过选择性地刺激缓激肽B1和B2受体进

而发挥广泛的生物学作用。本课题组前期研究指出KLK8上调诱导心肌肥厚以及

进展性心功能障碍,并且这一作用是依赖于EGF及PAR1/2信号通路而并非激肽受

体信号通路。

与此同时,本课题组同样发现KLK8上调诱导心肌间质纤维化,并且内皮细胞

功能紊乱触发的内皮间质转化(Endothelial-mesenchymaltransition,EndMT)

参与KLK8上调介导的心肌间质纤维化的发生。糖尿病是以长期高血糖为主要特

征,全身多器官系统病变的代谢紊乱综合征;据统计,2017年全球糖尿病患者人

数高达4.35亿;据估计,至2045年,全球糖尿病患者人数将超过6亿,糖尿病正逐

渐成为全球性疾病。

糖尿病如果不能够及时诊断、治疗将会引发多种并发症,包括糖尿病心肌病、

糖尿病肾病等,而后者以器官功能紊乱以及组织纤维化为主要特征。研究指出激

肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kininsystem,KKS)参与糖尿病及其并发症的

病理发生发展,然而其中的机制尚未完全阐明,那么是否KLK8参与糖尿病心肌病

以及糖尿病肾病器官功能紊乱以及组织纤维化的发生呢?因此,本研究在整体水

平上采用1型糖尿病小鼠模型,细胞水平上高糖处理HCAECs以及HRGECs,拟首先

观察KLK8在内皮细胞高糖处理时的表达改变,继而利用KLK8转基因和KLK8基因

敲除两种模式动物、通过整体和细胞水平的实验证实KLK8在糖尿病心肌以及肾

脏组织EndMT和间质纤维化病理发生发展过程中的关键作用,并阐明其分子机制。

主要实验结果如下:第一部分KLK8促进内皮间质转化在糖尿病心肌病心肌

间质纤维化中的作用及其机制研究一.高糖显著上调糖尿病小鼠心脏及冠脉内皮

细胞KLK8表达1.(1)腹腔注射STZ构建1型糖尿病小鼠,构建成功3/6个月后检

测心脏KLK8mRNA表达,糖尿病组KLK8表达显著高于对照组,并表现出明显的时间

依赖性;(2)人冠状动脉内皮细胞(Humancoronaryarteryendothelial

cells,HCAECs)给与5.5mM、15mM、25mM葡萄糖处理120h,对照组给与mannitol

处理;与对照组相比,高糖可显著上调KLK8在mRNA水平表达,并表现出明显的浓

度依赖性;二.过表达KLK8诱导人冠状动脉内皮细胞发生EndMT1.HCAECs给与

KLK8腺病毒转染72h以过表达KLK8,同空载体组相比,过表达KLK8可显著增加间

质细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(αSMA)与波形蛋白(vimentin)蛋白表达,降低

内皮细胞标志物血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)和内皮细胞钙粘蛋白

(VE-cadherin)表达,即诱导EndMT;(2)TGF-β1中和抗体部分阻断过表达KLK8

诱导的EndMT,即抑制KLK8诱导的αSMA与vimentin表达上调以及CD31与

VE-cadherin表达下调;二.KLK8上调参与高糖诱导的内皮细胞功能紊乱、EndMT

以及心脏纤维化应用KLK8siRNA以敲低内皮细胞KLK8表达,对照组给与等量

controlsiRNA;与对照组相比,KLK8siRNA可显著逆转高糖诱导的内皮细胞功能

紊乱,即内皮细胞损伤标志物vWF,sTM以及E-selectin均显著降低,内皮细胞活

力显著升高,而单独转染KLK8siRNA对内皮细胞功能无影响;此外,KLK8siRNA

可显著逆转高糖诱导的VE-cadherin与CD31蛋白表达下调以及αSMA与

vimentin蛋白上调;三.KLK8缺失可显著减轻糖尿病心脏组织纤维化以及心脏

EndMT1.KLK8缺失可显著减轻糖尿病心脏内皮功能紊乱以及心脏功能紊乱;(1)

小鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)以构建1型糖尿病小鼠,模型构建

成功后6个月检测血糖水平,同野生型组相比,野生型糖尿病组血糖显著增高,然

而