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生物化学及分子生物学实验考试-图文

一、实验原理步骤：1、分子克隆总流程：

分子克隆：在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。

常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，

通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛

选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，

从而获得目的基因的扩增。

流程：

（1）带有目的基因的DNA片段的获得——PCR引物设计，PCR获得。

（2）重组DNA分子的构建——与载体酶切连接。

（3）重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选——转化，培养，筛选

（4）检测——菌落PCR检测，粗提质粒检测，酶切检测，精提质粒测

序。

2、质粒DNA的提取及鉴定一一碱裂解法

原理：

根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离

质粒DNA。在pH12.0-12.5,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这

样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。

当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒

DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复

性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合

物等一起絮状沉淀下来而被除去。

步骤：1、细菌培养和收集①将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管

中，接入含质粒的大肠杆菌，37°C振荡培养过夜。（已完成）

②取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管）中，10000rpm离心lmin,

吸去培养液。

2、细菌裂解及质粒的提取

③将细胞沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。④加200ul溶液

II（新鲜配制），盖紧管盖，轻轻混匀内容物，将离心管放冰上5min。⑤加

150ul溶液III（冰上预冷），盖紧管口，轻轻颠倒数次使混匀。冰上放置10min。

⑥12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作好标记）中。3、质粒的纯

化

⑦向上清中加入等体积（450ul）酚:氯仿（1:1）（注意下层是有机相），

反复混匀。⑧12000rpm，离心2分钟，将上清小心地转移到另一离心管（标

记！）中⑨加入等体积（450ul）氯仿:异戊醇（24:1），反复混匀。⑩12000rpm，

离心2分钟，取上清液于新的EP管中。4、质粒的浓缩①加入2倍体积（900ul）

无水乙醇，混匀后，室温放置10T5min。②12000rpm离心5分钟，倒去上清

液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。③用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉

淀，振荡并离心，12000rpm离心2分钟，倒去上清

液，空气中干燥5—10min。5、质粒的溶解和保存及电泳检测④加20ulTE

缓冲液，其中含有100ug/ml的胰RNA酶使DNA完全溶解。⑤-20C保存⑥1%

胶，恒压150V，电泳10-20分钟

要点：载体定义：基因工程中携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表

达的工具。

类型：大肠杆菌中的质粒、噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人

工染色体载体及动、植物病毒载体等。

条件：复制子、咸志梅单一识别位点、标记基因、适合的拷贝数

碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同）

苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布）CCl法（EB插入

造成DNA浮力密度不同）

SDS裂解法（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清）玻璃纤维膜法（试剂

盒）

EDTA螯合Mg离子，抑制DNA酶活性，

3、质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测

原理：DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。

在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同

的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样.凝胶电泳不仅可分离不同分子质

量的DNA,也可以分离分子质量相同,但构型不同的DNA分子。超螺旋》线型》

开环步骤：1、酶切：

无菌ddH2O4ul