免检流式细胞术（免疫学检验课件）.pptx

流式细胞术;;;前言;第一节FCM的检测原理;一、细胞分析原理;（一）流式细胞仪基本结构;流动室和液流驱动系统

;;由激光光源、分色反光镜、光速成形器、透镜组和光电倍增管组成。

流式细胞仪的测定是基于对光信号的检测来实现的，因此光学系统是流式细胞仪中最为重要的一个系统。;;是进行实验数据的分析、存储、显示的重要组件，由计算机及相应的软件组成。

作用：将产生的各种光信号成比例的转换成电信号，进行数字化处理后转入电子计算机进行数据采集和分析。;;;;血液白细胞散点图;荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生。

特异性荧光探针与单克隆抗体结合后，与细胞膜或细胞内的靶抗原结合，经染色后的细胞在激光的照射下，荧光染料发出比激发光波长长的荧光，检测荧光素信号的强弱就可以了解抗原表达量的多少。;高度聚焦

激光束;入射光束

与液柱

垂直方向;不同光信号的转换;二、细胞分选原理;电荷式分选基本原理;（二）FCM分选指标;;三、流式细胞术的特点;（一）影响因素;（二）质量控制;确保标本上机检测前的浓度为1×106/ml，细胞浓度过低可直接影响检测结果。

封闭非特异性结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。

荧光抗体染色后需充分洗涤，注意混匀、低速离心，减少重叠细胞和细胞碎片。

注意避光染色，保证细胞免疫荧光的稳定。

设置对照样品，应采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。

判定结果时，应注意减去本底荧光，使免疫荧光的定量分析更准确。;第二节FCM的关键技术;以某一类细胞群为检测对象，因此为了减少检测时的干扰因素，常常在测定前把某一细胞群（单核细胞或血小板）从血液分离出来，制成单细胞悬液再进行标记染色。

制备单个核细胞悬液的最常用方法是单次密度梯度离心法;（二）培养细胞的单细胞悬液制备;将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细胞的目的又要不损伤细胞。

最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。;该制备方法的建立扩大了流式???胞术的应用范围，有利于进行临床回顾性研究和利用。

常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。

石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底，获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可获得单细胞悬液。

;FCM主要的信号参数包括散射光信号和荧光信号，荧光染色是保证荧光信号产生的关键步骤。

目前间接免疫荧光染色已较少用；直接免疫荧光染色以双色以上分析较为常用。

单色免疫荧光多用于单克隆抗体特异性较高、单一细胞群的抗原检测，多色免疫表型分析宜采用同一品牌的试剂。;（一）FCM常见荧光染料的种类和特性;常用荧光染料的特性和应用;1.直接免疫荧光染色法;;多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合成及抗体标记物的发展。

多色标记简便、省时、节约成本，但对操作人员的要求较高。

试剂的选择还需结合仪器的配置考虑。;自发荧光：未经荧光标记的细胞受到激光照射后所发出的荧光。

每种细胞群都有不同水平的自发荧光，如淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。

自发荧光易引起信号干扰，出现假阳性结果，在实际临床检验工作中应注意区别。

;流式细胞仪测定样品时，针对每个细胞都会记录各个光电器件所采集的检测信号，这些信号经过模/数电路转换后，全部结果传输到计算机中存储并分析。目前所使用的流式细胞仪为了对获取的数据更直观地进行观察和分析，多用图形化的方式对数据进行显示。;X轴代表一维参数。以通道表示，其与光强度之间的关系依放大器的性质而定，通道右侧信号的光强度明显高于左侧，越靠右侧光亮度越强。;双参数直方图是一种细胞与双测量参数的图形，X轴与Y轴分别代表一种参数。

双参数信号常采用对数信号，最常用的基本表示法是用点密图来显示。

如果把一个散点图分别投影到X轴和Y轴，可得到两个单参数直方图。

临床实践中常以多个散点图联合分析。;X轴反映SSC的信号强弱

Y轴反映FSC的信号强弱;把代表相同细胞数目的点依次连接起来形成密闭曲线，越在里面的曲线代表的细胞数目越多，越密集的区域也就是细胞数目变化最快的区间。;三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数

对复杂的细胞亚群观察更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难;FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术能够无法显示四维空间结构。

随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以获得所需的信息。

多参数分析能够同时比较各种细胞的不同抗原表达水平，可以统计出多种数据。

;指同一张单参数或双参数直方图中根据信号的强弱来划定分析