第四章代谢工程的基本思想.pptVIP

代谢工程

MetabolicEngineering;第四章代谢工程的基本思想;一、基本概念;一、基本概念;一、基本概念;一、基本概念;一、基本概念;一、基本概念;一、基本概念;微生物代谢的人工控制;五字策略：进、通、节、堵、出;二、生物合成途径的遗传控制;营养缺陷型;营养缺陷型;营养缺陷型;营养缺陷型;营养缺陷型;营养缺陷型;营养缺陷型;天冬氨酸;渗漏缺陷型;抗反馈调节;抗结构类似物;回复突变;产物降解酶缺失;增加前体物的合成;细胞膜组分缺失;细胞膜组分缺失;细胞膜组分缺失;细胞膜组分缺失;细胞膜组分缺失;细胞膜组分缺失;基因工程;三、生物发酵条件的控制;环境因素对谷氨酸发酵影响;发酵控制要解决的两个问题

发酵代谢途径问题---副产物少

发酵代谢速度问题---产物生成速率快

调控发酵条件包括

发酵温度、发酵醪基质浓度、含氧量、酸碱度、发酵时间

控制方法有:

通风、供热（冷）、调节培养基、流加补料;四、柠檬酸发酵;四、柠檬酸发酵;正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用

铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感

锰缺乏时，细胞内铵离子浓度高，氨基酸浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过升高铵离子而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的;糖酵解的代谢调节;TCA环的起始酶--柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点

顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活。顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7

黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低，它被葡萄糖和NH4＋抑止（第二个特点）;TCA循环的调节;氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2重新氧化时所需

标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少

当缺氧???，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降;透明圈大的菌株

平板：10%甘薯+2%的琼脂+0.5%CaCO3

诱变后，涂布，透明圈大的则好

显色圈大的菌株

平板：麦汁培养基+pH值指示剂

诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好

耐高柠檬酸且不分解柠檬酸的菌株

不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。

方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株;选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株

在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成

选育单氟乙酸、三氟乙酸敏感突变株

抑制乌头酸梅和异柠檬酸脱氢酶活性。若菌体对药品敏感，说明该突变株的乌头酸酶和异柠檬酸酶活力低或含量少

选育强化CO2固定反应的突变株

氟丙酮酸敏感、天冬氨酸缺陷、羧化酶基因克隆

强化柠檬合成酶;控制Mn2+和NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP畅通无阻

控制Fe2+浓度，使顺乌头酸水合酶失活

控制pH3，pH碱性，草酸增加；pH中性，葡萄糖酸增加

加大生物素用量，激活丙酮酸羧化酶;五、L-色氨酸发酵;操纵子;育种策略;育种策略;育种策略;育种策略;生物合成途径;代谢调节;育种策略;育种策略;七、青霉素发酵;代谢调节;代谢调节;代谢调节;代谢调节;育种策略;育种策略;发酵控制;谢谢！