TCA 蛋白沉淀方法.docVIP

100％（ｗ／ｖ）三氯乙酸得配制方法：

500g三氯乙酸用227ml水来溶解,所得溶液即１00％三氯乙酸溶液.避光,4度保存.(pｒeｐａｒaｔiｏnof100%TCA:454mlH2O/kgTCA、Ｍaｉntainｉnｄarkｂoｔtｌeaｔ4ｏＣ、Ｂeｃａrｅfｕｌ，usegloｖes！！！)、

培养基上清直接电泳跑出来得条带经常很难瞧，可以ＴCA沉淀浓缩后跑电泳，一般表达量大于1ｍg/ml可以瞧到明显条带，这就是我用得TCA沉淀方法，效果很好：

1、菌液1０0０0g，离心５分钟，收集表达上清。

2、取500－１000ul上清于EP管中，加入1/9体积得10０％TCＡ，颠倒10次混匀。

3、样品置于冰浴中大于0、5小时，过夜效果更好.

４、15000g，离心10－2０分钟,可见有棕黑色沉淀,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口得液体。

5、将EP管倒置于吸水纸长,37度烘箱１０—20分钟，待管底无明显液体残留，如果管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。可以改成室温或用电吹风，关键就是除去管底与管壁残余液体.

6、15000ｇ，离心10－20分钟,用20ｕl枪头尽量吸去管底残余得液体,此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般最多几ul或者没有，注意不要吸到沉淀.

7、ＥP管倒置于吸水纸长,37度烘箱5分钟，确认管壁与管底没有液体残留。

8、加入2０－５0ulLｏadｉｎgｂｕｆｆer，9５度加热１0nｉm，一般沉淀会自动溶解,如果不溶,用手指轻弹管壁或用２0ul枪头轻轻吸打,注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余ＴCA。如果蓝色得Loadinｇbuｆｆer不变成黄色，说明残余TCＡ吸弃了干净，如果变黄,一般不影响电泳。此方法连丙酮洗这一步都省了,而且不影响电泳效果。

或者第５步与第6步改为丙酮洗：

5、加入200ul冰冷得丙酮，用手指轻弹EP管,洗去管底与管壁残余得TCA.

6、１50００g,离心10－20分钟，倒掉上清,将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下,除去残余在管口得液体.

ＴＣA—DＯC

Fｏｒpｒｅｃiｐiｔationofｖeｒyｌoｗproteiｎcｏncenｔraｔioｎ

1)Ｔooｎevolｕmeofpｒotｅinｓolution,add1／10０vｏl、of２％DOC(Nadeoxychｏｌａte,ｄeｔerｇeｎt）、

２）Vorｔexanｄletsｉtfｏr30minａt4ｏC、?3)Adｄ１/10oｆTrichloｒｏaceｔiｃacid(ＴCA）100％vortexanｄｌetsiｔONat4oC(prepaｒationoｆ100%TCＡ：454ｍｌＨ2O/kｇTCA、Mａinｔａin?ｉｎdarkbottlｅaｔ4oC、Becarｅful，ｕseｇlｏves!！!）、

４）Sｐin1５ｍiｎ4oCｉnmicroｆｕｇｅatmaxｉmumspeed（1５０00ｇ）、Ｃarefuｌlｙdｉschａrgeｓupernaｔantaｎdretainthepellet:drｙtｕbebyｉｎverｓｉonｏｎtissuｅpapｅｒ（pelletmaybｅｄifficulttosee）、[ＯPTION:Wasｈｐelｌeｔtwiｃewithｏnevｏlumｅofcoldａｃｅtone（aｃｅｔonekeepaｔ–20oC）、Ｖorｔexandrepeｌｌｅtsaｍplｅs5ｍinaｔｆullsｐeedｂeｔｗeｅｎwａｓhes］、

５）Dryｓaｍｐlesuｎdervaccuｍ（ｓｐｅｅdvａｃ)orｄryａｉr、FｏrＰAGＥ—SDS,resuspｅｎdsａmｐlｅsinａminimalvoｌuｍｅofsaｍpleｂｕffｅｒ、(TｈepｒesenceofsomeTＣＡcangiｖｅayeｌｌowｃｏｌourａsaｃonｓeｑｕeｎcｅoftｈeaciｄificａtioｎofthesamplebuｆｆer;titｒatｅwｉth1NNaOHｏr1MTrｉｓＨCｌpH8、５ｔｏｏbｔainthenormalbluesａmplｅｂuｆfｅrcolｏur、)

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NｏrmａlTCＡ?ToeliminateＴCAsolubleiｎtｅｒferｅncesandｐrｏteｉncoｎc