禽白血病通用AJ三重PCR检测技术规程.docxVIP

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禽白血病通用/A/J三重PCR检测技术规程

1.范围

本文件规定了禽白血病通用/A/J三重PCR检测方法的主要仪器设备、试剂、引物、样品处理、样

品DNA/RNA提取、反转录、多重PCR扩增、结果判定。

适用于禽白血病病毒核酸通用/A/J的三重PCR检测。

2.规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注明日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注明日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于

本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

GB19489实验室生物安全通用要求

《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发〔2017〕25号）

3.术语与定义

下列术语与定义适用于本文件。

3.1

禽白血病病毒Avianleukosisvirus

禽白血病病毒是反转录病毒科（Retroviridae）成员，根据病毒囊膜糖蛋白抗原特异性、病毒干扰试验及宿主范围，ALV被分为11个亚群（A~K）。其中，对鸡具有致病性的外源性ALV主要包括A、B、

和J亚群。

4.主要仪器设备

4.1PCR扩增仪。

4.2台式高速冷冻离心机：可控温至4℃,离心力12000g以上。

4.3全自动组织快速碾磨仪。

4.4涡旋震荡器。

4.5核酸电泳仪。

4.6凝胶成像系统。

4.7可调微量移液器：最大量程分别为10μL、50μL、100μL、1000μL。

4.8电子天平：精确度0.001g。

3

5.试剂

5.1病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒和反转录试剂盒：商品化试剂。

5.2DNA核酸生物染料：商品化试剂。

5.3DNA分子量标准：DL2000Marker,商品化试剂。

5.42×FastTaqpremix：商品化试剂。

5.5灭菌一级水：符合GB/T6682,121℃,20min，高压蒸汽灭菌。

5.650×TAE电泳缓冲液，见附录A.1。

5.71.5%琼脂糖凝胶，见附录A.2。

5.80.1MpH7.4PBS，见附录A.3。

5.9阴性对照：健康鸡血液或者组织悬液。

5.10阳性对照：pMD-18-T-pol、pMD-18-T-A/gp85、pMD-18-T-J/gp85重组质粒。

6.引物

引物序列见表1，委托有资质的公司进行合成。

表1禽白血病通用/A/J三重PCR引物

引物名称

引物序列

扩增基因

扩增基因片段长度(bp)

ALV-pol-F

5-TACTTGAGCCCTTGCGACTC-3’

pol基因

145

ALV-pol-R

5-ATGGTGAACCCGGCTCTTTC-3’

ALV-A-F

5-TTACATGGGCCAACCGTACA-3’

gp85基因

274

ALV-A-R

5-GGTGGCTCATCCCACATAGA-3’

ALV-J-F

5-AGGCCCTATGTCAACCAATCA-3’

gp85基因

338

ALV-J-R

5-GCCCTGTCCCCACAAATCAA-3’

7.样品的采集、运输与保存

按照NY/T541的规定执行。

8.样品处理

8.1鸡的血液和公鸡精液等样品直接用于提取样本RNA。

8.2肿瘤或其他组织等样品

取样品约1g放入2mL离心管中，加入1mL无菌0.1MPH7.4PBS后，放于全自动组织快速碾磨

4

仪进行研磨（研

磨管中加入2～3粒灭菌钢珠），制备组织匀浆，5000g离心15min，取上清液用于样本RNA提取。

8.3泄殖腔拭子的处理

将泄殖腔拭子样品在振荡器上充分混合后，将拭子中的液体充分挤压后弃去拭子，室温静置作用

30min,3000r/min离心5min,取上清转液用于样本RNA提取。

9.试验步骤

9.1RNA的反转录

通过反转录试剂盒将上述提取的RNA反转录为cDNA。试剂和程序如下所示。

表2反转录反应体系

成分

用量

2×ESReactionMix

10.0μL

RandomPrimer(N9)

1.0μL

EasyScriptRT/RIEnzymeMix

1.0μL

提取的RNA

500ng

RNase-freeWater后总体积

20.