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山羊胚胎生产及冷冻保存技术规范

1范围

本文件规定了山羊胚胎生产及冷冻保存的技术要求。

本文件适用山羊胚胎生产及冷冻保存。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T1571羊胚胎移植技术规程

NY/T1674牛羊胚胎质量检测技术规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1超数排卵Superovulation

利用外源性促性腺激素诱发雌性动物卵巢多个卵泡发育，并排出多个具有受精能力的卵子的方法。

3.2体外受精Invitrofertilization

哺乳动物的精子和卵子在人工控制的体外环境中完成受精过程。

3.3玻璃化冷冻Vitrification

利用含有高浓度的渗透性抗冻保护剂溶液处理胚胎，然后将胚胎装入冷冻载体并直接投入液氮快速降温，使液体形成玻璃态，可有效减少冷冻过程中有害冰晶的形成，使胚胎所受物理性伤害大大降低的一种胚胎冷冻方法。

3.4慢速冷冻Slow-freezing

利用含有低浓度的渗透性抗冻保护剂溶液处理胚胎，然后将胚胎装入冷冻载体并按照一定程序于程序冷冻仪中植冰和降温，最后置于液氮中保存的一种冷冻方法。

3.5体外受精胚invitro-fertilizedembryo

通过体外受精获得的胚胎。

4胚胎生产

4.1超数排卵胚生产

4.1.1药品与器械

孕酮阴道栓（CIDR）、氯前列烯醇（PGF2α)、促卵泡素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）（或促黄体素（LH），或促排3号）、青霉素、链霉素、复合麻醉剂、PBS液（附录A1）、冲配液（附录A2）、胚胎操作液（附录A3）、生理盐水、75%酒精、碘酊；手术台、植栓枪、羊用冲胚管、滞留针（18G）、手术剪、手术刀、止血钳、缝针（圆针、三棱针）、外科手术缝线、注射器、连续变倍实体显微镜、恒温台、检胚皿、培养皿。

4.1.2供体母羊选择

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所选用供体母羊必须符合品种要求或标准（有国标或地标的品种，参照品种标准），连续三代内系谱清楚、健康无病，发育到性成熟后，繁殖机能正常的个体。

4.1.3饲养管理

保持饲养环境温度稳定、适宜、卫生，避免应激；制定合理的供体羊饲粮配方，保证蛋白质、能量、维生素和微量元素等营养平衡，保持中等膘情；供给清洁饮水，适当运动。

4.1.4超数排卵

用植栓枪将CIDR（含孕酮300～500mg）放入供体母羊阴道内，放置CIDR之日为0d，第9d第二次补栓，第15d起早晚间隔12h肌肉注射FSH，注射总量100～200IU（或10～15mg），每天按照总量的5:3:2递减连续注射3d，第16d上午注射完FSH后立即撤CIDR，同时注射氯前列烯醇2mL。

4.1.5发情鉴定与诱导排卵

注射完FSH后，观察母羊发情情况。对有发情征兆的母羊，采用公羊试情，以供体母羊愿意接受试情公羊爬跨，判断为发情。做好发情时间记录，同时静脉注射hCG500～800IU，或肌注LH50~100IU，或肌注促排3号10～20μg。

4.1.6配种

可采用自然交配或人工授精进行发情母羊的配种。自然交配配种2次，人工授精输精3次。发情时立即配种1次，每间隔12h再配第2或第3次。人工授精，可使用鲜精或冻精，鲜精活力≥0.7以上，冻精解冻后活力≥0.3，每次输精有效精子数3×107个，输精容积0.5mL～1mL。

4.1.7手术冲胚

采用羊胚胎移植技术规程（NY/T1571-2007）中5.1部分。

4.2体外受精胚生产

4.2.1药品和器械

超数排卵药品、消毒药品、外科手术器械和常用器械见4.4.1。肝素、卵母细胞体外成熟培养液、体外受精液、早期胚胎体外培养液；CO2培养箱、CO2钢瓶、超净工作台。

4.2.2卵母细胞收集

4.2.1.1活体取卵

按照4.1.2选择供体母羊，按照4.1.4对供体母羊进行超数排卵处理。在第6次注射FSH前12h禁食，最后1次FSH注射12h，参见羊胚胎移植技术规程（NY/T1571-2007）中5.1中外科手术方法暴露卵巢，用生理盐水浸润的纱布包裹卵巢，用预吸有抽卵液（附录A4），用带12号针头的5mL注射器抽吸卵巢上所有直径3～6mm的有腔卵泡中的卵丘卵母细胞复合体（COCs）和卵泡液，抽吸