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一、生命大分子制备

1、生物大分子得特征：

（1）由结构比较简单得小分子所组成

（2）具有非常复杂得结构

2、生物大分子制备难度：

（1）生物材料得组成极其复杂

（2）许多生物大分子在生物材料中得含量极微，分离纯化得步骤繁多，流程又长

（3）许多生物大分子极易失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜得环境与条件

（4）溶液得温度、PH值、离子强度等各种参数综合影响溶液中生物大分子得制备，很难准确估计与判断，个人得实验技术水平与经验对实验结果会有较大得影响。

3、生物大分子制备得通常步骤：

（1）确定要制备得生物大分子得目得与要求

（2）建立相应得可靠得分析测定方法

（3）通过文献调研与预备性实验，掌握生物大分子得物理化学性质

（4）生物材料得破碎与预处理

（5）分离纯化方案得选择与探索

（6）生物大分子制备物得纯度得鉴定。要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC与毛细管电泳都就是一个峰

（7）产物得浓缩，干燥与保存

4、蛋白质得分离纯化：

（1）材料获得：天然获得；基因工程手段获得

（2）粗分离：除去大量杂质与杂蛋白，初步浓缩目得蛋白

（3）细分离：常压柱层析：分子筛层析、离子交换层析、疏水层析、亲与层析

（4）鉴定：纯度、浓度、活性

5、蛋白质得结构研究：

（1）一级结构：氨基酸组成分析、末端分析、肽谱分析

（2）二级结构：紫外光谱法、荧光光谱法、园二色性法、红外光谱法、激光拉曼光谱法

（3）高级结构：X-射线衍射法、核磁共振法

（4）结构与功能得关系：突变、晶体分析、蛋白与蛋白得相互作用

6、酶活力：酶催化一定化学反应得能力。

7、酶活力单位：每分钟催化生成一微摩尔产生所需要得酶量为一个酶活力单位。

8、制备生物大分子得方法：

（1）以分子大小与形态得差异为依据得方法：差速离心、区带离心、超滤、透析与凝胶过滤等

（2）以溶解度得差异为依据得方法：盐析。萃取、分配层析、选择性沉淀与结晶等

（3）以电荷差异为依据得方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析与离子交换层析等

（4）以生物学功能专一性为依据得方法：亲与层析等

9、酶得比活力：每毫克酶蛋白所含有得酶活力单位娄，就是酶制剂纯度得一个指标

10、回收率：纯化过程中酶活性得收率

11、纯化位数：指提纯后与提纯前酶比活力得比值

增大纯化位数与缓慢降低回收率得方法属于有应用价值得方法。

12、蛋白质得鉴定：

（1）浓度：紫外法、Lowry法、Bradford法、凯氏定氮法、双缩脲法

（2）纯度：电泳法、化学法、仪器法

（3）分子量测定：SDS、凝胶过滤、氨基酸组成分析、毛细管电泳

（4）等电点：等电聚焦电泳

（5）活性：激酶、磷酸化酶、利用靶酶活性、氧化还原酶、ELISA。

二、沉淀法

1、沉淀法：

纯化大分子物质得一种经典方法。

操作简单，成本低廉。不仅用于实验室中，也用于某些生产目得得制备过程，就是分离纯化生物大分子，特别就是制备蛋白质与酶时最常用得方法。

沉淀就是溶液中得溶质由液相变成固相析出得过程，可以有选择性得沉淀杂质或有效成分。

原理：不同物质在溶剂中得溶解度不同而达到分离得目得(又称溶解度法)

改变溶液得某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中各种物质得溶解度发生变化。选择适当得溶液就能使欲分离得有效成分呈现最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或者相反，有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大溶解度。然后经过适当处理，即可达到从抽提液中分离有效成分得目得。

2、沉淀可以分为可逆性沉淀与不可逆性沉淀

可逆性沉淀：在沉淀过程中，有效成分结构与性质都没发生变化，在适当得条件下，可以重新溶解形成溶液。可逆沉淀就是分离与纯化有效成分得基本方法，如等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法。

不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液得稳定性，而且也破坏了蛋白质得结构与性质，产生得蛋白质沉淀物不可能再重新溶解于水溶液。加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物碱沉淀。（沉淀物一般就是杂质）

3、常用得沉淀方法与沉淀剂：

（1）盐析法：选用中性盐为沉淀剂，多用于各种蛋白质与酶得分离纯化。

（2）有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子，多糖及核酸类产品得分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。

（3）等电点沉淀法：用于氨基酸，蛋白质及其她两性物质得沉淀，但单独应用较少，多与其她方法结合使用。

4、制备蛋白质：

（1）盐析法：

在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出得过程称为“盐析”。

1-1．优点：①成本低，不需要特别昂贵得设备。

②操作简单、安全。

③对许多生物活性物质具有稳定作用。

在纯水中加入少量中性盐，蛋白质得溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。

但中性盐得浓度增加至一定时，蛋白质得溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。

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