重组蛋白的原核表达 .pdfVIP

实验三重组蛋白的原核表达、亲和层析

及免疫印迹分析

一、实验内容

1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。

2．对重组蛋白进行亲和层析，得到纯度较高的融合蛋白。

3．对纯化结果进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）检测，并做蛋白质的Western

blot鉴定。

二、实验目的和要求

1．了解重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达的原理和实验方法。

2．掌握亲和层析基本原理和操作过程。

3．掌握蛋白质的免疫印迹分析。

三、实验操作步骤

1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。

①将在甘油保存的重组蛋白的表达菌株BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、

BL21（pET43.1a）、Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1）

取少量分别接种于10mlLA（LB+100mg/L的氨苄青霉素）培养基中，37℃下过夜培

养。

②以1：100转接至100mLLA液体培养基中培养至OD0.5-0.6。加入0.5mM的

IPTG诱导表达，诱导表达温度为18℃，诱导时间为9小时。

③将诱导表达的菌液于10000rpm离心5min，收集菌体，-20℃保存。

④将菌体细胞重悬于5mL缓冲液bufferI（20mmoL/LTris-HCLpH8.0，150

mmoL/LNaCl）（表达菌株BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、BL21（pET43.1a））

或PBS（Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1））中。

⑤取0.5ml悬浮液，冰浴条件下进行超声波破菌，4℃下12000rpm离心20min。

分别取上清和沉淀，作SDS检测，估计可溶性表达比例。

⑥将以上④得到的重悬液在冰浴中进行超声波破菌，4℃下12000rpm离心20min，

其上清即为蛋白粗提液（BL21（pET-IL-2）、BL21（pET43.1a）、Origami（pGEX-ES1）、

Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1））或沉淀（BL21（pQE-IL-2））。其中，

菌株BL21（pQE-IL-2）表达的目的蛋白为包涵体，需将以上沉淀溶解于5ml含有8mol/L

尿素的BufferI中，即为蛋白粗提液。

（以上得到的蛋白粗提液为样品1——留样、测定蛋白含量、SDS-化）

2.重组蛋白的亲和层析纯化（离心法，亲和介质为NTA）

1）在1.5ml的离心管中分别加入1ml亲和介质NTA悬浮液,

2）2000g，3min离心弃上清；

3）加入1mL无菌水重悬介质，2000g，3min离心弃上清；

4）重复3次步骤3）。

5）加入1mL100mM的NiSO4溶液重悬介质，轻摇10min进行Ni2+的吸附，2000g，

3min离心弃上清；

6）重复3次步骤5）。

7）加入1mL无菌水重悬介质，2000g，3min离心弃上清；

8）重复3次步骤7）。

9）加入1mLbufferI重悬介质，2000g，3min离心弃上清；

10）重复5次步骤9）。

11）加入1mL蛋白粗提液（分别来自于BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、BL21

（pET43.1a））重悬介质，轻摇10min进行亲和吸附。2000g，3min离心，收集上

清（样品2——留样、蛋白含量测定、SDS化）

12）重复3次步骤11）。（合并样品2）

13）加入1mLbufferI重悬介质，进行洗涤。2000g，3min离心弃上清；