重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达 .pdfVIP

实验报告

题目:单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达

指导老师:邓庆丽

日期:2013/10/31-201311/1

一．实验目的：

(1)了解和掌握IPTG诱导表达的原理和操作方法。

(2)了解降解物阻遏的现象及其机理。

二．实验原理：

本实验使用的是载体是已重组好的pGFPuv，宿主细胞为大肠杆菌，目的基因的产物为

融合蛋白，目的蛋白为绿色荧光蛋白GFP，非目的蛋白即融合部分为标签6×His，用于单元

四的亲和层析分析。

本实验采用的启动子为可调控的强启动子乳糖操纵子lac。

操纵子是原核基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节

序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序

列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成，如下图1所示：

乳糖操纵子的调节包括诱导效应和降解物阻遏效应。

(1)诱导表达

当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与

操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因（本实

验中的绿色荧光蛋白基因GFP）不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖

存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态，如下图2所示：

当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白

的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3’端移动，于

是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖

操纵子被诱导，如下图3所示：

乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，

它的诱导作用是持久的。

(2)葡萄糖降解物的阻遏作用

代谢物基因激活蛋白（CatabolitegeneActivationProtein）CAP，又称cAMP受体蛋白属

于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP

结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合DNA促进乳糖操纵子的转录。

葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP

的浓度，抑制乳糖操纵子的转录。

本实验使用的表达载体pGFPuv上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因表达的是带6

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×His的重组绿色荧光蛋白。在IPTG的诱导下，融合蛋白表达可增强10倍，并且可用金

属螯合亲和层析分离纯化，最终获得纯的重组绿色荧光蛋白。

三．材料与试剂：

(1)材料

工程菌：BL21(DE3)p32a、BL21(DE3)pGFPuv

(2)试剂

LB液体培养基：蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeastextract）5g、NaCl10g，加

800mL双蒸水溶解，用10MNaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。

分装，高压灭菌，4℃保存。

氨苄青霉素溶液：无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20℃保存，使用终浓度为50μ

g/mL或100μg/mL。

IPTG溶液（100mM）：将238.3mgIPTG溶解于10mL双蒸水，0.22μm细菌滤器过滤

除菌，分装，-20℃保存备用，贮存浓度为100mM。

20%葡萄糖溶液

超声平衡缓冲液：50mMTris-HCl,500mMNaClpH7.0

四．实验仪器：

超净工作台、低温摇床、高速冷冻离心机、超声破碎仪等。

五．实验步骤、现象、结果及分析：

1.工程菌的活化(10月30号教师准备)晚上7点接