人IL-15亚型蛋白及其制备方法和应用 .pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN101838327A

(43)申请公布日2010.09.22

(21)申请号CN201010180688.8

(22)申请日2010.05.24

(71)申请人刘海燕

地址215127江苏省苏州市吴中区甪直镇鸿运花园A18

(72)发明人刘海燕胡博

(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司

代理人李纪昌

(51)Int.CI

C07K14/54

C12N15/24

C12N15/70

A61K38/20

A61P37/02

A61P1/00

A61P1/16

A61P5/44

A61P11/00

A61P11/06

A61P17/06

A61P19/02

A61P19/04

A61P19/08

A61P25/00

A61P29/00

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

人IL-15亚型蛋白及其制备方法和

应用

(57)摘要

本发明涉及一种人单抗蛋白的制

备，特别涉及一种人IL-15亚型蛋白的制

备及其应用；制备在免疫体系处于激发态

下制备人IL-15亚型蛋白，通过体外实验

检测其对正常人IL-15蛋白的拮抗作用，

提供该亚型蛋白在自身免疫性疾病等临床

治疗中的应用；本研究证明，未经LPS刺

激的外周血细胞检测不到该种亚型，而在

LPS刺激后的正常人外周血中可检测到该

亚型，提示该亚型有可能在免疫系统激活

的条件下发挥着重要的负反馈调控功能；

本发明首次在免疫系统激活状态下发现了

该亚型蛋白，并做了其功能的相关研究，

从而为其在机体免疫调控中发挥的作用提

供了更为直接的证据。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.一种人IL-15亚型蛋白，其特征在于氨基酸序列为SeqNO.4。

2.一种人IL-15亚型蛋白，其特征在于编码基因序列为SeqNO.3。

3.一种人IL-15亚型蛋白的制备方法，其特征包括以下步骤：

(1)扩增人IL-15亚型基因片段：取正常人外周血，制备外周血单个核细胞PBMC

悬液，使用0.1μg/ml-100μg/mLPS作用24h-72h刺激，获得刺激后的外周血单个核

细胞PBMC悬液，通过Trizol-氯仿法抽提总RNA；根据NCBI所公布人IL-

15cDNA序列NM-000585及pET43.1原核表达载体的结构设计特异性引物

SeqNO.1和SeqNO.2，经逆转录-PCR操作扩增获得人IL-15目的片段；

(2)获取人IL-15亚型基因克隆：取步骤1所得PCR产物，按照凝胶回收试剂盒说

明回收IL-15基因亚型片段；将回收所得PCR产物与PGEM-T克隆载体连接、4℃

连接过夜；取连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质

粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列SeqNO.3；

(3)构建重组人IL-15的pET43.1原核表达载体：取测序鉴定正确的步骤2所得质粒

及原核表达载体pET43.1，分别进行SacI、XhoI内切酶双酶切并按照凝胶回收试

剂盒说明书回收酶切所得片段；将回收所得酶切片段连接过夜，取连接产物转化感

受态DH10B菌，挑菌，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒酶切鉴定；

(4)pET43.1-IL-15亚型基因转化菌的表达：取鉴定正确的步骤3中重组质粒转化感

受态细胞BL21(DE3)，挑取单菌落，抽提质粒，酶切鉴定，筛选正确转化的表达

菌pET43.1-IL-15/BL2