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原核表达（原理、材料与实验方案）

一、原理

1、E.coli表达系统

E.coli是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E.coli菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌

内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS以检测表达蛋白质。

2、外源基因的诱导表达

提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿

主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因

表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。

二、材料

1、诱导表达材料

(1)LB（Luria—Bertani）)培养基

酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10g

NaCl10g琼脂(Agar)1-2%

蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7.0

适用范围：大肠杆菌

(2)IPTG贮备液：2gIPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，－20℃

保存。

(3)l凝胶电泳加×样缓冲液：

50mmol/LTris-CI(pH6.8)

50mmol/LDTT

2%SDS（电泳级）

0.1％溴酚蓝

10％甘油

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

1）酶溶法

（1）裂解缓冲液：

50mmol/LTris-CI(pH8.0)

1mmol/LEDTA

100mmol/LNaCI

（2）50mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）。

（3）10mg/mL溶菌酶。

（4）脱氧胆酸。

（5）1mg/mLDNaseI。

2）超声破碎法

(1)TE缓冲液。

(2)2×SDS凝胶电泳加样缓冲液：

100mmol/LTris-HCI(pH8.0)

100mmol/LDTT

4%SDS

0.2％溴酚蓝

20％甘油

三、实验方案

1、外源基因的诱导表达

(1）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。

(2）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。

(3）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱，DNA序列测定，

确定无误后进行下一步。

(4）如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30-32℃培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6，

迅速使温度升至42℃继续培养3-5h；如果表达载体的原核启动子为tac等，则37℃培养细菌数小时

达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L。继续培养3-5h。

(5）取上述培养液1mL,1000g离心，1min，沉淀，加100μL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，

作SDS检测。

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化

1）细菌的裂解

常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法；④酶溶法；⑤化学渗透等。前三种方法属

机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下

面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3-葡聚糖酶；β-1,6-葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。

溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：

①4℃，5000rpm离心，15min，收集诱导表达的细菌培养液（100mL）。弃上清，约每克湿菌加3

mL裂解缓冲液，悬浮沉淀。

②每克菌加8μLPMSF及80μL溶菌酶，搅拌20min；边搅拌边每克菌加4mg脱氧胆酸（在冷室中进

行）。

③37℃，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μLDNaseI。室温放置至溶液不再粘稠。

（2）超声破碎法。声频为15-20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品

时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA进行剪切，大大降低液体的粘稠度。

①收集1L诱导表达的工程菌，40℃，5000r