一种重组工程介导的大肠杆菌基因组点突变的方法 .pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN102703424A

(43)申请公布日2012.10.03

(21)申请号CN201210203212.0

(22)申请日2012.06.19

(71)申请人南京师范大学

地址210046江苏省南京市栖霞区亚东新城区文苑路1号

(72)发明人尚广东蒋伏欢张飞飞石牡丹

(74)专利代理机构南京知识律师事务所

代理人卢亚丽

(51)Int.CI

C12N15/09

C12N15/63

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

一种重组工程介导的大肠杆菌基因

组点突变的方法

(57)摘要

本发明涉及一种基于重组工程的大

肠杆菌基因组点突变的方法。本方法是先

通过重叠－延伸聚合酶链式反应获得一个

两端为与靶位点两侧序列一致的各50bp同

源臂，中间为突变位点、与靶位点下游序

列一致的30bp同源片段、两侧为两个归巢

核酸酶I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基

因的修饰片段；然后将50bp同源臂之间的

片段整合至大肠杆菌基因组，突变位点取

代基因组上的靶位点，获得卡那霉素抗性

突变株。随后热失活的氯四环素诱导I-

SceI酶的表达，催化30bp同源片段与靶位

点下游30bp之间发生同源重组，从而将

30bp同源片段、两个I-SceI酶切位点及卡

那霉素抗性基因消除，获得发生点突变的

大肠杆菌突变株。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.一种基于重组工程的大肠杆菌基因组点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）通过重叠－延伸聚合酶链式反应获得一个DNA修饰片段，所述DNA修饰片

段依次由下列结构组成：与基因组上位点待突变靶位点上游50bp序列一致的左端

50bp同源臂、突变位点、与靶位点下游30bp序列一致的30bp同源片段、两侧为

两个归巢核酸酶I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因和与靶位点下游50bp序列一

致的右端50bp同源臂所组成；

（2）将含重组酶基因和I-SceI基因的质粒pLS134转化至大肠杆菌MG1655中；

所述的质粒pLS134是将PCR扩增的tetR-ptetA-I-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，

克隆至pBAD322的NsiI位点，得到重组克隆pLS133；再将exo，bet和gam三个

重组酶基因从lambda噬菌体DNA中PCR扩增后，以NcoI和XhoI酶切后，克隆

至pLS133的NcoI和SaII位点，得到目的质粒pLS134；

（3）将步骤（1）得到的DNA修饰片段电转化至以终浓度为0.15%的L-阿拉伯糖

诱导下表达Red重组酶基因的步骤（2）的大肠杆菌电转化感受态细胞中，通过重

组酶介导的同源臂和大肠杆菌基因组上相同序列之间的同源重组，将所述DNA修

饰片段中，左右50bp同源臂之间的片段整合至大肠杆菌基因组，在卡那霉素抗性

筛选之下，获得整合有突变位点、30bp同源片段和两侧为I-SceI酶切位点的卡那

霉素抗性基因的卡那霉素抗性突变株；

（4）将步骤（3）得到的菌株在含终浓度为20μg/ml热处理的氯四环素的培养基中

进行培养，热失活的氯四环素诱导I-SceI酶的表达，I-SceI酶作用于整合在基因组

上的I-SceI酶切位点，基因组发生双链断裂，促使菌株利用自身的重组功能催化

30bp同源片段与靶位点下游30bp之间发生同源重组，从而将30bp同源片段、两

个I-SceI酶切位点及卡那霉素抗性基因消除，最终获得发生点突变的大肠杆菌突变

株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所待突变位点和突变位点是一个或多个碱

基。

3.如权利要求