试验二-淀粉酶活性测定预习报告.docxVIP

生物化学实验预习报告

实验二酶活力测定方法的研究（1）

―淀粉酶活性的研究

一、研究背景

酶即由活细胞产生的一类有催化活性的生物大分子，大多数由蛋白质组成（少数为RNA），它是细胞赖以生存的基础，细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。酶的催化具有高效性、专一性、可调节性以及需要温和的条件。酶的催化活性受外界条件的影响，如温度、pH、离子强度、激活剂、抑制剂等均会使酶活性发生改变。另外，酶在工业生产及生活中应用广泛，如酱油、食醋以及酿酒工业都需要酶的参与，洗衣粉加入酶增强去污能力等。酶活性的测定具有较强的实际意义，例如某些酶活性的变化可以引起特定的疾病，测定这些酶的活性可以作为疾病诊断的一个依据。

淀粉酶是水解淀粉糖昔键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的方式，可以分为a-淀粉酶与B-淀粉酶等。休眠的种子中只有B-淀粉酶存在，而a-淀粉酶在种子萌发过程中才形成。测定淀粉酶的活性具有重要的意义，淀粉酶普遍存在于植物体内，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，其活性高低可以衡量种子萌发速率，也可以作为水稻抗逆性的生化指标（如干旱、盐、重金属胁迫）。本实验中我们通过学习经典的淀粉酶活力测定方法，分析具体的实验细节，从而获取酶活力测定的相关理念。

二、研究目标

.掌握酶活力测定的一般思路与方法；

.进一步熟练使用分光光度法测定物质浓度；

.测定a-淀粉酶与0-淀粉酶的活性；

.体会并掌握实验细节的设计与分析方法。

三、研究策略

两种淀粉酶的特性有所不同，a-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；0-淀粉酶不耐热，在70c15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化0-淀粉酶，测出a-淀粉酶的活力（原因分析见思考题6）。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（a-淀粉酶活力+0-淀粉酶活力），再减去a-淀粉酶的活力，就可求出0-淀粉酶的活力。另外，实验时分别设置对照组和测定组，从而排除无关变量的干扰。采用分光光度法测定产物麦芽糖的含量，计算出产物的生成速率，从而表征出淀粉酶的活性。

四、研究方案及可行性分析

.研究方案

（1）酶的获取

淀粉酶广泛存在于禾谷类的种子（特别是萌发后的种子）中，所以取萌发的小麦种子研磨浸提得到初始酶液。

（2）反应过程

a-淀粉酶耐高温，而0-淀粉酶在高温下易被钝化。可以在适当的高温下水浴处理，使0-淀粉酶失去活性的同时a-淀粉酶活性基本不受影响，与此同时，设置对照组以排除干扰因素（如萌发种子中产生的麦芽糖），对比测定组与对照组的差异，分解淀粉所得到的产物就可以认为是a-淀粉酶催化的产生，即可得到a-淀粉酶活力。另外，不做高温处理，在相同的测定条件下测量a-淀粉酶和肉淀粉酶的总活力，最终计算两者差值得到%淀粉酶活力。

（3）产物检测（还原糖的3,5-二硝基水杨酸法）

淀粉水解产物为麦芽糖，在碱性条件下，麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），在一定范围内，麦芽糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，在520nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。

（4）酶活力计算

酶活力的大小与所催化反应的产物生成速率成正比。规定淀粉酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数（mg麦芽糖?min-rg-i鲜重）。以分光光度法测定产物麦芽糖的含量，计算出产物的生成速率，最终得到酶的活力。

.可行性分析

就实验方案本身而言，利用两种酶的不同特性加以处理，钝化其一，测定另一种酶的活性，方案合理，简便易行，具有可操作性；实验材料（萌发小麦种子）可在实验室获得，所需各种试剂均为实验室常备试剂，温度控制可通过恒温水浴箱实现，分光光度计、离心机等仪器实验室都有，所用试管、研钵等器具实验室均可提供；实验所用时间约为3h（下文会粗略计算），可在规定时间内完成，故时间上有可行性。综合以上各点，本实验具有很大的可行性。

.预期实验结果

a-淀粉酶与0-淀粉酶活力均可通过本实验测得。

五、具体实验设计

.实验仪器及试剂

722型光栅分光光度计、托盘天平、离心机、恒温水浴锅、具塞刻度试管、50ml容量瓶、研钵、石英砂、微量可调手动移液器、1%淀粉溶液、蒸馏水、pH5.6的柠檬缓冲液、3,5-二硝基水杨酸溶液（DNS）、麦芽糖标准液（1mg/ml）、0.4MNaOH溶液、萌发的小麦种子

.实验步骤

（1）初始酶液的制取（30min）

2g萌发的小麦种子一少量石英砂，研磨至匀浆一少量多次用蒸馏水转移到50ml容量瓶至40ml一颠倒浸提15~20minf定容至刻度一混匀一3500r/m