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猪瘟疫苗(传代细胞源)生产工艺研究

礼颖;王春雪

【摘要】猪瘟是一种传染性疾病,是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一.由猪

瘟病毒引起,因其流行广、发病率及死亡率高,猪瘟的防控工作也变得越来越艰巨.接

种疫苗是控制猪瘟的主要途径,试验通过对猪瘟传代细胞源的工艺优化研究,以获得

较好的生产工艺技术参数,从而确保提高产品效价和稳定性.

【期刊名称】《饲料博览》

【年(卷),期】2017(000)007

【总页数】4页(P26-29)

【关键词】ST细胞;消化;接毒,效价

【作者】礼颖;王春雪

【作者单位】哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限

公司,哈尔滨150069

【正文语种】中文

【中图分类】S828;S852.65+1

猪瘟由猪瘟病毒（CSFV）引起，流行广，发病率及死亡率较高，是目前危害我国

养猪业发展的主要疫病之一[1-4]。随着我国猪瘟的流行越来越复杂，猪瘟的防控

工作也变得越来越艰巨。接种疫苗是控制猪瘟的主要途径[5-12]。

猪瘟活疫苗的生产中越来越多的采用传代细胞源生产工艺方法，此方法简化生产过

程，减少了动物源的原材料的使用，但在培养过程中效价的稳定性与高低成为工艺

研究重点，本文主要采用一些试验方法，使抗原效价有所提高，并确定其关键工艺

参数。

1.1细胞及毒株

使用细胞为ST细胞，保存液氮罐中，生产用为10代以内；种毒为猪瘟兔化弱毒

株（脾毒），保存温度-80℃冰柜，生产用毒种（3代）。

1.2主要试剂及试验动物

5倍MEM溶液、7.5%碳酸氢钠溶液、犊牛血清、青链霉素溶液、EDTA-胰酶分

散液；检测用培养基普通琼脂、普通肉汤、40%葡萄糖溶液、酪胨琼脂斜面

（G.A）、硫乙醇酸盐酪胨汤（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P）；试验过程中所使用动

物为大耳白家兔。

2.1细胞制备

ST细胞消化5～10min后培养48h的形态观察见图1，细胞消化45～50min

后培养48h的形态观察见图2，细胞消化65～70min后培养48h的形态观察见

图3，ST细胞传代过程中细胞生长情况记录见表1。

从工作细胞库中取出1支冻存ST细胞置37℃水浴中融化，待冻存细胞液完全溶

解，放置离心机中，1000r·min-1离心7min。弃上清，移入装有含营养液的细

胞培养瓶中，置37℃含5%CO2培养箱中培养，24h换液继续培养，待形成良好

细胞单层后扩大培养至转瓶培养。

取生长良好单层的ST细胞，用PBS溶液中和细胞表面残留物质后弃掉，再加入

E-EDTA溶液，37℃温室中进行消化，待消化至肉眼可见瓶壁表面出现针尖样划痕

或间隙，显微镜下观察可见细胞出现圆缩、脱落时，弃掉部分消化液（剩余10～

30mL消化液），于37℃温室中继续消化。

201501批：待消化5～10min后，加入少量营养液对单层细胞进行吹打，制成

细胞悬液，采取按1∶3分装比例传代增殖。

201502批：待消化45～50min后，加入少量营养液对单层细胞进行吹打，制成

细胞悬液，采取按1∶3分装比例传代增殖。

201503批：待消化65～70min后，加入少量营养液对单层细胞进行吹打，制成

细胞悬液，采取按1∶3分装比例传代增殖。

3组细胞均置于37℃温室增殖培养，对ST细胞的形态及增殖情况进行观察，并记

录。

2.2接毒

不同接毒量的试验效果对比见表2，3%接毒24hST细胞的形态观察见图4，5%

接毒24hST细胞的形态观察见图5。

细胞数达到90%～100%刚形成单层的ST细胞，随机选取1转瓶继续传代作为对

照组，剩余随机分成3组（201504、201505、201506），用同步接毒的方法分

别接入含3%、4%和5%的猪瘟兔化弱毒株（脾毒）病毒维持液，37℃温室中转

瓶培养。接种后每日观察1～2次，对ST细胞病变情况进行观察并记录，选择有

80%单层细胞出现典型CPE时即可收获。采用倍比稀释法对病毒含量测定。

每只兔耳静脉注射1mL（平行注射两只兔子）。测量体温，按兔体产生体温反应

确定病毒量是否合格。符合定型热反应（++）为合格可进行第2次传代。

接种家兔的体温反应分为4类：定型热反应（++）潜伏期24～48h