融合蛋白表达实验报告 .pdfVIP

基因构建与表达实验报告

实验一目的基因扩增与纯化回收

一、聚合酶链式反应

实验目的：通过PCR反应将目的片段扩增出来，获得足量的目的片段。

实验原理：DNA双螺旋在90-95℃解链形成单链；50-55℃引物与单链结合；70-72℃TaqDNA

聚合酶从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5’—3’方向合成

新的DNA链。经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。

实验仪器和材料：PCR仪PCR管移液器tip枪头

实验试剂：

双蒸水（ddH2O）

10×PCR缓冲液(含Mg2＋)

4种10×dNTP混合

Taq酶（EasyTaq）

DNA模板

两种引物（上游和下游）

实验步骤：

1、配制PCR反应体系

试剂ddH2OEasyTaqdNTPEasy甘油上游下游DNA

BufferTaq酶引物引物模板

100ul大6510100.210222

体系

注：一般情况下先依次加入ddH2O、10×Buffer、10×dNTP、EasyTaq酶、甘油配体系分

装到PCR管中（100ul/管），再加入对应的上下游引物和模板

2、放入PCR仪，按照实验设计的温度进行PCR，反应参数如下：

(1)94℃预变性4min；

(2)94℃变性1min；

(3)55℃退火1.5min；

(4)72℃延伸2min；

(5)重复(2)-(4)30个循环；

（6）72℃终延伸10min；

二、琼脂糖凝胶电泳检测

实验目的：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量的大小，检测目的基因片段是否扩增出来。

实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性溶液中

带有负电荷，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定

孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可

以按照分子量大小得到有效分离。溴化乙锭（EB）可插入到DNA分子的相邻碱基之间，在

紫外光的照射下出现荧光，从而指示DNA含量和位置。

实验仪器：电泳仪、紫外检测仪、水平电泳槽、移液枪、一次性手套

实验试剂：TAE、EB溶液、凝胶加样缓冲液、琼脂糖

实验步骤：

1、1%琼脂糖凝胶的制备（以制备5块胶为例）：

（1）称取琼脂糖1.6g，加入160ml1xTAE缓冲液，在微波炉上加热溶解煮沸熔化，取出摇

匀至无沉淀。

（2）取有机玻璃内槽，放置于水平位置，用移液枪吸取少量胶将有机玻璃内槽两端密封。

冷却到60℃左右（手感温度不烫手即可）加入7ulEB溶液，摇匀后倒入有机玻璃内槽，等

距插入5个样品梳子。

（3）冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中，加入TAE电泳缓冲液没过胶面。

2、加样

用移液枪取缓冲液，依次点3ul缓冲液在点样板上，再取PCR样品溶液10ul左右与缓冲液

混匀后，加入样品孔中，并记录好点样顺序。（大体系PCR产物需要回收，点样时更换枪头

避免交叉污染）

3、电泳及结果观察

接通电泳槽与电泳仪的电源，170V恒压电泳20min，电泳至溴酚蓝接近胶底部边缘即可；

电泳完毕，取出凝胶，放在紫外灯下观察DNA条带的位置，根据DNA条带与溴酚蓝的相

对位置估算DNA分子量大小，记录结果。

三、DNA片段回收：

1、摇匀GS树脂，用移液枪取500ul树脂分装于1.5mlEP管中，将PCR大体系产物加入到

GS树脂中，用移液枪吹打混匀，静置10min，让片段结合到GS树脂上

2、将混合液转入纯化柱中，13000rpm瞬时离心，弃收集管中液体

3、加600ul80%异丙醇洗脱两次，13000rpm瞬时离心，弃收集管中液体，13000rpm空甩

20min；取出回收柱放入干净的1.5mlEP管中，放入30-40摄氏度烘箱烘干10min左右，使

异丙醇完全挥发。

4、取出加入50ulddH2O