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化妆品美白实验(鱼胚实验)实验方法
1.范围
本标准规定了化妆品美白功效的斑马鱼鱼胚实验的实验原理、实验准备、
实验方法和实验结果。
第一法为显微观察法,适用于液态水基类、膏霜乳液、凝胶类、可溶性粉
剂化妆品原料及其产品的美白功效定性观察。
第二法为黑色素生成抑制检测,适用于液态水基类、膏霜乳液、凝胶类、
可溶性粉剂化妆品原料及其产品美白功效定量检测。
第三法为酪氨酸酶活性抑制检测,适用于液态水基类、膏霜乳液、凝胶类、
可溶性粉剂化妆品原料及其产品美白功效定量检测。
2.定义
hourspost-fertilization(hpf):受精后小时数
3.规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件,凡不注明日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所
有的修改单)适用于本文件。
化妆品安全技术规范2020版
GB/T6678化工产品采样总则
GB/T6679固体化工产品采样通则
第一法显微观察法
4.检测原理
受试样品配置成溶液孵育鱼胚72h后,于体式显微镜下观察,可根据黑色
素在鱼胚体表的沉积,观察到黑色素含量的变化。
5.实验材料与试剂
5.1.材料
5.1.1.斑马鱼交配盒
5.1.2.鱼胚收集器
5.1.3.细胞培养板:6孔细胞培养板
5.2.试剂
5.2.1.二甲基亚砜
5.2.2.二甲基亚砜标准储备液(1%):量取二甲基亚砜标准品1.0mL(精确至
0.1ml),用斑马鱼系统养殖水稀释并定容至100mL容量瓶,于28℃保存。
5.3.对照品
5.3.1.熊果苷标准品,纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物。
5.3.2.熊果苷标准储备溶液(1mg/mL):称取熊果苷标准品10mg(精确至
0.01mg),用斑马鱼系统养殖水溶解并定容至10mL容量瓶,于28℃保存。
6.实验仪器与设备
6.1.斑马鱼养殖系统
6.2.连续变倍体式显微镜(带拍照功能)
6.3.恒温培养箱
6.4.天平:精密度0.00001g
6.5.软件:SPSS统计分析软件、Origin函数绘图软件
7.实验步骤
7.1.实验准备
7.1.1.鱼胚品系:野生型AB系斑马鱼自然交配的胚胎;
7.1.2.鱼胚要求:以斑马鱼开始交配受精为0hpf,选用8~10hpf健康、无畸
形、正常发育的鱼胚用于实验;
鱼胚死亡的表现形式:胚胎的凝固,体节形成缺失,尾未分化和心跳缺失,
任何这些观察结果中的一个阳性结果都意味着胚胎的死亡。
鱼胚畸形的表现形式:脊柱弯曲,心胞水肿,尾部弯曲,血管堵塞等。
7.1.3.鱼胚孵育温度:28±1℃;
7.2.样品提取
7.2.1.水溶性样品:使用斑马鱼系统养殖水将受试样品稀释成0.01、0.1、1、
10、100mg/mL实验浓度,混匀,于4℃保存备用。
7.2.2.非水溶性样品:使用二甲基亚砜标准储备液(1%)将受试样品稀释成
0.01、0.1、1、10、100mg/mL实验浓度,混匀,于4℃保存备用。
7.3.对照组溶液
7.3.1.空白对照组溶液:斑马鱼系统养殖水
7.3.2.溶剂对照组溶液:二甲基亚砜标准储备液(1%)
7.3.3.阳性对照组溶液:熊果苷标准储备溶液(1mg/mL)
7.4.实验方法
随机挑选8~9hpf健康、无畸形、正常发育的鱼胚用于实验。使用6孔细胞培养板为实验载体,每组设置3个平行组,每孔加入鱼胚20枚,受试样品组加入受试样品溶液5mL,空白对照组加入斑马鱼系统养殖水5mL,溶剂对照组加入二甲基亚砜溶液(1%)5mL,阳性对照组加入熊果苷标准储备溶液
(1mg/mL)5mL,置于恒温培养箱28℃孵育。
8.实验结果
于24、48和72h时在体式显微镜下观察,并拍照记录。其中,每组实验取3尾鱼胚用于拍照,拍照时固定拍照参数,将鱼胚平躺固定,聚焦鱼胚卵黄囊部位进行拍照,拍照时固定拍照参数,将鱼胚平躺固定,聚焦鱼胚卵黄囊部位
进行拍照,观察各组斑马鱼体表黑色素的分布面积和数量。
9.质量控制
9.1.1.基本原则:测试中设置的对照检测应符合以下情况,如出现非下述标准,
则视为质控不合格。
9.1.2.根据观察结果,与空白组和阳性对照组相比,可明显观察到体表黑色素
的分布面积和数量减少,说明受试样品有效。
第二法黑色素生成抑制检测法
10.检测原理
受试样品配置成溶液孵育鱼胚72h后,通过对鱼胚破碎、离心,
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