精液冷冻技术.ppt

关于精液冷冻技术精液冷冻的历史（一）探索1776年，Spallanzani发现精液在自然冰雪中冷冻后复温部分精子恢复活力1938年，Jahnelv发现精液储存于-79℃的玻璃管40天后复温部分恢复活力1940年，Shettles置精液于毛细玻璃管内-196℃储存，存活率不超过10%突破1949年，Polge等发现用甘油作为冷冻精子的保护剂第2页,共23页，5月，星期六，2024年，5月精液冷冻的历史（二）奠基1954年后的十年中，Sherman发明了使用10%甘油作保护剂，用-196℃液氮蒸气作制冷剂的方法，获得76%的冷冻生存率，得到普遍认可发展在Sherman发明的方法基础上，从冷冻方法、保护剂种类等方面的研究发展迅速稳定经过多年的发展，精子冷冻技术相对稳定，探索不止第3页,共23页，5月，星期六，2024年，5月精液冷冻的原理（一）一、冷冻精液长期储存的原理一定的低温条件下细胞内的分子运动速度减慢甚至停止细胞代谢降低，处于休眠状态一般认为-196℃的液氮是安全的第4页,共23页，5月，星期六，2024年，5月精液冷冻的原理（二）二、冷冻对精子的损伤机理1、溶质损伤效应：（慢速冷冻损伤）温度降低至冰点细胞外液中的水分先形成冰晶细胞外液电解质浓度增加，渗透压增高水分从细胞内流向细胞外，细胞发生收缩胞外冰晶的不断形成使高渗状态和细胞收缩持续进行过度暴露在高浓度溶质环境或过度收缩，引起损伤第5页,共23页，5月，星期六，2024年，5月精液冷冻的原理（三）2、冰晶的机械损伤效应：（快速冷冻损伤）温度降低达到细胞内冰点未能转移至胞外的水分形成冰晶破坏胞内的超微结构，引起死亡Wolley等人的研究显示，超微结构的变化是发生在融化期间或融化之后第6页,共23页，5月，星期六，2024年，5月精液冷冻的原理（四）三、精液冷冻的基本原理冷冻损伤是肯定的在两种损伤之间寻找平衡点，即最佳的降温速率使两种损伤的总和达到最小，得到最大的冷冻生存率实现起来非常困难冷冻保护剂的出现是一大突破第7页,共23页，5月，星期六，2024年，5月冷冻保护剂的作用机理（一）一、冷冻保护剂的分类1.根据化学结构分类：醇类、酰胺类、高分子多糖类、单糖类、蛋白质类、无机盐类等2.根据作用机理分类：（1）渗透性冷冻保护剂：丙三醇、DMSO、乙二醇等（2）非渗透性冷冻保护剂：右旋糖酐、羟乙基淀粉、卵黄等第8页,共23页，5月，星期六，2024年，5月冷冻保护剂的作用机理（二）二、渗透性冷冻保护剂的作用机理1、渗入细胞内，降低细胞内外渗透压的差距。当细胞外冻结时，减轻细胞皱缩的程度和速度2、细胞外保护剂的存在，可以降低细胞外液中溶质的浓度，减少高浓度溶质对细胞的损坏3、能与细胞内水分及电解质结合的特性，导致水合结构蛋白的稳定，发挥抗冻作用4、仅对慢速冷冻有保护作用第9页,共23页，5月，星期六，2024年，5月冷冻保护剂的作用机理（三）三、非渗透性冷冻保护剂的作用机理此类物质不能进入细胞，冷冻时促进细胞内水分外溢，细胞发生皱缩，从而减少了细胞内的冰晶形成对快速冷冻和慢速冷冻都有保护作用卵黄的作用：卵磷脂能稳定精子的细胞膜，阻止顶体膜破裂，抵抗“温度休克”第10页,共23页，5月，星期六，2024年，5月冷冻保护剂的作用机理（四）四、冷冻保护剂的联合作用1.冷冻保护剂剂量增加，其低温保护作用增强2、冷冻保护剂的毒性作用3、两种毒性机理不同的冷冻保护剂合用，可以达到相同的效果，而减少毒性作用4.渗透性冷冻保护剂与非渗透性冷冻保护剂联合使用第11页,共23页，5月，星期六，2024年，5月冷冻的程序和方法（一）一、冷冻过程中精子通过的温度阶段温度休克阶段室温~+5℃冰晶的潜热阶段+5℃~-5℃冰晶的形成阶段-5℃~-15℃再结晶阶段