离子交换层析技术.ppt

离子交换纤维素的选择—解离曲线*第83页,共107页，星期六，2024年，5月离子交换纤维素的解吸洗脱缓和。升高环境的pH、降低pH或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。*第84页,共107页，星期六，2024年，5月离子交换纤维素的处理和再生酸碱浓度要适当降低，处理时间也从4h缩短为0.3~1h。以交换缓冲液平衡。注意：不耐酸，用酸处理的浓度和时间须小心控制。*第85页,共107页，星期六，2024年，5月（二）葡聚糖凝胶离子交换剂是将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。命名:交换活性基团-SephadexC(A)-编号。具有离子交换和分子筛的双重作用，对生物分子有很高的分辨率。*第86页,共107页，星期六，2024年，5月常用的离子交换葡聚糖*第87页,共107页，星期六，2024年，5月琼脂糖凝胶离子交换剂琼脂糖凝胶上引入功能基DEAE—sepharoseCL-6BCM—sepharoseCL-6BDEAE—ToyopearlCM—Toyopearl*第88页,共107页，星期六，2024年，5月多糖基离子交换剂应用

——尿激酶分离纯化*第89页,共107页，星期六，2024年，5月补充—离子交换聚焦色谱色谱聚焦（chromatofocusing）:是一种高分辨的新型的蛋白质纯化技术。是根据蛋白质的等电点，结合离子交换技术的大容量色谱，能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦效应浓缩，分辨率高。适用水溶性的两性分子，如蛋白质、酶、多肽、核酸等。*第90页,共107页，星期六，2024年，5月一、色谱聚焦的原理（一）自动形成pH梯度。（二）蛋白质的色谱行为（三）聚焦效应*第91页,共107页，星期六，2024年，5月PH梯度溶液的形成在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。*第92页,共107页，星期六，2024年，5月PBE94柱聚焦色谱的pH梯度*（1）柱内每点的PH值从高到低逐渐下降。（2）从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。（3）PH梯度会逐渐向下迁移。（4）底部流出液的PH由9逐渐降至6。第93页,共107页，星期六，2024年，5月蛋白质的色谱行为当柱中PH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，不与阴离于交换剂结合,随洗脱液向下移动。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来而下降。移至pH大于PI时又重新结合，直至蛋白质从柱下流出。不同蛋白质具有不同的等电点，在被离子交换剂结合以前，移动距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。*第94页,共107页，星期六，2024年，5月聚焦效应当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处时，移动速度明显减慢。此时加上相同的第二个样品，它将以洗脱液移动的速度下降，直至追到正在慢移的第一个样品（聚焦）。如果加入的第二个样品的等电点比第一个样品高，它可以越过第一个样品区先被洗脱出来。*第95页,共107页，星期六，2024年，5月三、多缓冲交换剂PBE94是以交联琼脂糖6B（Sepharose6B）为载体，并在糖基上通过醚键偶合上配基制成的多缓冲交换剂，是阴离子交换剂。当Polybuffer96流进多缓冲交换剂时，PH梯度溶液可以自动形成（9—6）。*第96页,共107页，星期六，2024年，5月四、操作步骤（一）凝胶和缓冲剂的选择PBE94Polybuffer96PBE94Polybuffer74pH间隔为3个单位。pH范围应包含要分离样品各组分等电点，并使其有2/3~1/2柱长的吸附解吸时间。*第97页,共107页，星期六，2024年，5月（二）凝胶柱的准备（1）凝胶按1∶1悬浮于起始缓冲液中，除气泡。（2）柱垂直除底部尼龙网下的气泡，关闭柱下端出口。（3）在柱中放2~3ml起始缓冲液，搅拌下缓缓倒入。（4）打开柱底部开关，待凝胶沉降后将柱顶部接头装好。（5）用10~15个柱床体积起始缓冲液平衡。*第98页,共107页，星期六，2024年，5月（三）、样品的准备100mg蛋白质/10ml床体积。样品体积不超过0.5个床体积。*第99页,共107页，星期六，2024年，5月（四）、上样和洗脱样品均匀平整地加到床面上；上样前应先加5ml洗脱液