膜蛋白纯化解决方案 .pdfVIP

膜蛋白纯化解决方案

膜蛋白是一种位于细胞膜上的蛋白，主要分为外周膜蛋白和跨膜

蛋白两大类。膜蛋白具有重要的生物功能，如控制能量转换、参与信

号转导、控制物质运输、维持细胞和组织结构等，因此膜蛋白一直是

研究热门，是当前近70%的药物靶标。

想要研究更具体膜蛋白结构或者功能特性，我们首先要提取纯化

相应的膜蛋白。接下来以一篇经典Nature文章为例，解析如何提取纯

化膜蛋白。

2019年Nature文章：人的Tcellreceptor–CD3复合体结构研

究

纯化思路：

（1）重组蛋白的构建：

以哺乳细胞HEK293F为表达宿主，在C末端依次加了Strep和

His标签。

目的基因：TCRα，TCRβ（pCAG)+CD3γ、δ、ε、ζ

（pcDNA3,4）。

（2）重组蛋白的诱导表达：

在37℃、含有5%CO2条件下，120rpm培养60h。

（3）细胞膜结构的制备和溶解：

通过离心收集细胞，然后匀浆破碎。

细胞膜结构组份的收集：用25mMHEPES，pH7.5,1MNaCl缓

冲溶液重悬，加入1mMPMSF，100,000g超速离心30min收集细

胞膜结构组份。

细胞膜结构的溶解：用25mMHEPES，pH7.5,150mMNaCl，

1%DDM，0.2%cholesterylhemisuccinatetrissalt,1mMPMSF,

4℃条件下溶解2h。

40,000g离心30min，收集上清，即为可溶的膜蛋白粗溶液。

（4）亲和层析纯化：

本文作者用StrepTactin填料进行纯化。

结合条件：4℃结合3h；

Washbuffer:25mMHEPES，pH7.5,300mMNaCl,0.06%

digitonin;

Elutionbuffer:25mMHEPES,pH7.5,150mMNaCl,0.06%

digitonin+4mMdesthiobiotin

图1亲和层析后，各个亚基的SDS图

（5）膜蛋白复合体交联

蛋白质浓缩后用0.1%(v/v)的戊二醛交联40min，得到膜蛋白复合

体。

（6）凝胶过滤分子筛层析：

用Superose6increase10/300,buffer为25mMHEPES,pH

7.5,150mMNaCl,0.06%digitonin

图2TCR-CD3复合体SDS图

膜蛋白复合体TCR-CD3交联后进行凝胶过滤分子筛层析，进行

SDS实验，发现得到比较纯的复合体。

（7）TCR-CD3结构分析

通过冷冻电镜分析，TCR–CD3复合物的最终原子模型包含全长

TCRαβ的亚基，完整的ECD和跨膜螺旋CD3γε，CD3δε和CD3ζζ

图3TCR–CD3复合体结构图

看完大佬的实验框架，是不是顿时对自己的实验也有了一些思路？

总结一下，膜蛋白的一般研究流程：

蓝色背景分别是表达系统与去垢剂的选择，是整个流程中至关重

要的步骤。

膜蛋白的表达系统：原核表达（大肠杆菌、红杆菌属）、哺乳细

胞（HEK293F）、酵母表达、昆虫细胞表达。不同的表达系统的优缺

点见下图。

去垢剂的选择：去垢剂别名表面活性剂、乳化剂、肥皂等等，分

为离子型、非离子型和两性离子型三类。去垢剂是同时具有亲水性和

疏水性基团的双极性分子，能够使磷脂双分子层解体并释放膜蛋白，

并且为去膜状态下的膜蛋白提供稳定的疏水环境。去垢剂也需要筛选

合适的种类和浓度，各自优缺点见下图。

蛋白纯化：使用亲和+凝胶过滤（分子筛）即可完成膜