构建真核表达载体和融合载体经验pcr .pdfVIP

此方法可能很多师兄师姐们都在用，只是当时的确没

有找到相关的详细说明，学弟再次把自己摸索出来的

一点心得写出来，高手就多多指正，没做过的就相互

学习下，见笑）

由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体

起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了

他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性

我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体

挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个

按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定

结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片

段）

也难怪老板一口回绝

只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，

累死人不偿命

后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1mychisC载

体和pEGFP载体）

.0的MCS两端有T7和SP6

如果我用T7和SP6作为引物，则

1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段

2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp

如下图所示：

后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6

因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段

这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题

如下图：

总结如下：

1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）

选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物

如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R

或SP6+目的基因-F

pCDNA3.1mychisC（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-R

pEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测

序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）

仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合

2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）

挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中

37°C200rpm摇床摇2-4小时以上

（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35

个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应

少些，一般28-30个循环）

3.菌液的处理

无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀

释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）

提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤

多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉

我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后

述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸

4.pcr体系：无特殊要求

同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，

除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度

5.模板的量：1-2ul

未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反

应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌

落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没

有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）

6.退火温度：55-58°C

此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C

或者58°C完成

T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°

我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目

的条带

7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来

8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑

到的确可能细胞