17-基因工程克隆策略-zsy.ppt

基因工程克隆策略基因工程实验设计1、目的基因的序列分析2、载体的选择和分析3、克隆策略的设计4、引物的设计目的基因的序列分析1、分析ORF：找到需要克隆的核酸序列2、分析酶切位点：（1）酶切位点为0的酶；可通过引物加入，方便克隆；（2）酶切位点为1和2的酶：用于酶切克隆或基因和重组质粒的酶切分析。载体的选择和分析1、根据目的选择合适的载体质粒：克隆、表达或其它用途。2、MCS(多克隆位点）是否有合适酶切位点（一般是基因上没有的酶切位点)3、表达载体，要注意表达框架配对。4、载体的酶切位点，用于重组鉴定。克隆策略的设计1、平端克隆；2、粘端克隆（1）TA克隆（2）单酶切不定向克隆（3）双酶切定向克隆平端克隆机械打断，化学合成，EcoRV酶切，或其它酶切位点末端改造（Klenow酶补平，S1处理）产生平端；克隆效率较低，ligase要加大量；载体需脱磷；方向可正可反。TA克隆1、普通Taq酶扩增的PCR产物3‘末端会多加一个A;2、公司提供的T-vector的5’末端有一个粘性的T;用途:(1)PCR产物快速克隆：（2）基因测序（可正可反）；（3）利用T-vector上的MCS,为下一步克隆调整酶切位点单酶切不定向克隆载体需要脱磷（否则，自连效率极高，外源基因无法插入）；基因插入可正可反，需要筛选。双酶切定向克隆类型：（1）粘-粘连接：最有效、最快捷（2）粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平特点:(1)基因和载体都用两种酶切割；(2)连接效率高；(3)外源基因插入方向固定，不用鉴定。定向克隆的注意点：（1）两个同尾酶切出的末端一样，相当于单酶切不定向克隆；（2)载体MCS中的两个酶切位点要远一点，防止一端没切透；（可选用中间插入其它基因片断的载体酶切回收制备）。一般是基因上没有或1个的酶切位点*载体脱磷，连接后得到的杂种DNA分子上会留下3’-OH和5’-OH的缺口。尽管如此，这样的DNA分子仍然可以导入细菌细胞，并在寄主细胞被完成缺口的修复工作。*一般是基因上没有或1个的酶切位点*载体脱磷，连接后得到的杂种DNA分子上会留下3’-OH和5’-OH的缺口。尽管如此，这样的DNA分子仍然可以导入细菌细胞，并在寄主细胞被完成缺口的修复工作。*