烟草新驱动蛋白基因NtTKR原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化.pdfVIP

烟草新驱动蛋白基因NtTKR原核表达载体的构建、

诱导表达及蛋白纯化

通过cDNA文库差异筛选方法，成功分离出了一个新基因

NtTKR（Nicotianatabacumkinesinrelatedprotein），该基因是驱

动蛋白超家族中的一员。NtTkr与现已知的广泛表达的多数植物

的驱动蛋白不同[1-3]，该基因仅在植物的叶和各发育时期的胚中

优势表达。这一特异表达模式说明它可能在胚胎发生及叶分化过

程中具有独特的功能[4-5]。

众所周知，多数蛋白质需与其他蛋白质互作才能发挥其自身

的作用。因此，为了解NtTkr这一新发现的蛋白的功能，通过对

NtTkr尾部的酵母双杂交筛选，得到多个与NtTkr互作的候选蛋

白。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株、质粒

DH5α、BL21（DE3）菌株、原核表达载体pMXB10及含NtTKR

全长的pGBKT7-NtTkr质粒由笔者所在实验室保存。

1.1.2工具酶及试剂

PCR所用的KOD-plus高保真酶、10×KOD-缓冲液、dNTPs

（浓度均为2mmol/L）、25mmol/LMgSO4，均购自ToYoBo公

司；在*****公司购买PCR产物纯化和DNA凝胶回收试剂盒；于

TaKaRa公司购买T4DNA连接酶、DNA标准分子量Marker和限

制性内切酶；几丁质亲和柱购自NEB公司；于Fermentas公司

购买蛋白分子量标准；其余试剂购于生工生物工程（上海）股份

有限公司或Sigma公司。

1.2方法

1.2.1質粒制备与SDS

主要参照Sambrook的方法。采用碱裂解法制备质粒，CaCl2

法进行转化。SDS：各蛋白样品与等体积2×上样缓冲液

（100mmol/LTris-HCl，200mmol/LDTT，4%SDS，20%甘油，

0.12%溴酚蓝，pH值为6.8）混合，煮沸5～10min后，13000

r/min离心5min，取上清液进行SDS。

1.2.2PCR扩增及扩增产物的克隆和鉴定

由北京三博远志生物工程公司合成引物，引物序列：正向

KNs，5′-********************-3′，反向Kca，5′-

*************************GGC-3′，以含NtTKR全长的pGBKT7-

NtTkr质粒为模板进行PCR扩增，产物经电泳检测，结果正确后，

用引物两端引入的NdeⅠ和NotⅠ双酶切PCR产物，电泳回收

NtTKR片段。

1.2.3原核表达载体构建与鉴定

pMXB10经NdeⅠ和NotⅠ双酶切，凝胶回收片段，于16℃

下用T4DNA连接酶连接该载体片段与NtTKR片段，16h后得

到连接产物。将该产物转化DH5α超感细胞，经筛选得到成功转

化重组质粒的DH5α，扩大培养该细胞，然后提取质粒，酶切鉴

定质粒，鉴定结果无误后，将该重组质粒PMXB10-NtTkr-3582

送往北京三博远志生物工程公司进行测序。

1.2.4目的蛋白的诱导表达及SDS检测

将测序无误的PMXB10-NtTkr-3582质粒转化为BL21（DE3）

感受态细胞，转化液涂布在LB+50mg/mL氨苄青霉素（Amp）

培养基上进行筛选，然后挑取单克隆至液体LB+Amp培养基中

于37℃、180r/min下过夜培养，次日按1∶[KG-*3]100稀释菌

液，37℃下培养4h左右至其D600nm为0.8时，分别经0、

0.06、01、0.6mmol/LIPTG于37℃诱导4h，取2mL菌液，于

4℃、1000r/min离心1min，弃上清收集菌体。然后，分别加

入100μL去离子水和还原型2×SDS上样缓冲液悬浮菌体，三

者混匀后煮沸10min，取15μL样品进行SDS鉴定。

1.2.5目的蛋白的纯化

目的蛋白的纯化参照李