绿孔雀检疫技术 第3部分：羽虱实验室检测技术规范.docxVIP

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DB53/TXXXX—2021

绿孔雀检疫技术

第3部分：羽虱实验室检测技术规范

1范围

本文件规定了绿孔雀（Pavomuticus）检疫技术中羽虱实验室检测技术的原理、试验条件、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理。

本文件适用于绿孔雀检疫技术中羽虱实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

羽虱Chewinglice

羽虱是主要寄生在鸟类体表和少数寄生于哺乳动物的永久性体表寄生虫，隶属于昆虫纲（Insecta）、有翅亚纲（Pterygota）、虱目（Phthiraptera）、长角羽虱科（Philopteridae）。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BLAST：基于局部序列比对算法的有哪些信誉好的足球投注网站工具Basiclocalalignmentsearchtoolbp：碱基对Basepair

ddH2O：双蒸水Doubledistilledwater

DNA：脱氧核糖核酸Deoxyribonucleicacid

NCBI：美国国家生物技术信息中心NationalcenterforbiotechnologyinformationPCR：聚合酶链式反应Polymerasechainreaction

TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液Trisacetate-EDTAbuffer

5原理

根据羽虱的形态特征，采用显微镜镜检方法，判定是否有羽虱感染，对于虫卵、若虫、存疑虫体及残破虫体无法确定其种类，可进行PCR鉴定。

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6试验条件

6.1实验室通用要求

实验室满足GB19489中生物安全实验室的要求。

6.2人员要求

采样和试验人员为具有相应的专业知识的人员。

7仪器设备和试剂

7.1仪器设备

7.1.1体视显微镜。

7.2.2载玻片、培养皿、离心管、样品管。

7.2.3PCR仪。

7.2.4微量移液器：单道可调，量程0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL和100μL~1000μL。

7.2.5电子天平：量程0.01mg～10000mg。

7.2.6恒温水浴锅：36℃±1℃,65℃±1℃。

7.2.7高速离心机：转速可达12000r/min。

7.2.8电泳系统。

7.2.9微波炉。

7.2.10凝胶成像系统。

7.2试剂

7.2.150×TAE缓冲液：Tris碱242g和57.1mL冰醋酸，用双蒸水定容到1L。

7.2.2核酸染料，用于凝胶成像显示条带。

7.2.32×TaqPCRMix。

7.2.4引物（基于COI基因设计引物）。

7.2.5霍氏液。

7.2.6乙酸乙酯。

7.2.770%乙醇。

7.2.8商品化DNA提取试剂盒。

7.2.9DL2000DNAMarker。

7.2.10琼脂糖。1.5%琼脂糖凝胶：1.5g琼脂糖与100mL1×TAE缓冲液，加热融化均匀，60℃时，倒入胶槽，插上样品梳。室温下待凝胶凝固后，垂直向上拔出固定在凝胶中的样品梳。

8样品

8.1样品采集

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在体表皮肤、毛根、羽毛处找到淡黄色或暗灰色的虱体或虫卵，收集放入样品管中，做好记录。刚死亡绿孔雀可将其放入有乙酸乙酯的密闭容器中，熏蒸5min后，用手逆向拨动羽毛，羽虱掉落,将羽虱收集放入样品管。

8.2样本保存

将羽虱样本保存于70%乙醇内，拧紧盖子后上下摇晃使虱体充分浸泡在70%乙醇中，并检查是否有液体渗漏。低温或置于4℃冰箱储存。

8.3样品运输

样品采集完成后运输到实验室进行检测。70%的乙醇属于危险化学品，运输过程中要确保容器不泄漏、不损坏。不应与酸类、易燃物、自燃物品等并车混运。

8.4生物安全要求

样品采集及试验过程中做好自身防护，羽虱虫卵常附在羽毛和皮屑上，对绿孔雀的生活环境进行清扫、环境消毒。生物安全要求按照GB/T27401的规定进行。

9试验步骤

9.1形态学检查

9.1.1直接观察法

按下列区域顺序对绿孔雀进行检查：翅(下侧)、腹侧、腹部、臀部(下侧)、胸部、翅(上侧)、背部、臀部(上侧)、颈部、头部。观