13 载体 本科精品课件.ppt

考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb）能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒载体：pUC118/119pUC118pUC18+M13间隔区IGpUC119pUC19+M13间隔区IG500个拷贝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13辅助噬菌体DNA考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒载体：pBluescript体外转录载体pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录提取出来的单链DNA重组分子在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录人造染色体载体人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）人造染色体载体细菌人造染色体（BacterialArtificialChromosomesBAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（genecluster）结构构建动植物基因文库人造染色体载体酵母人造染色体（YeastArtificialChromosomesYAC）YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列酵母人造染色体的构建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的中心粒序列酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350-400kb人造染色体载体酵母人造染色体（YeastArtificialChromosomesYAC）酵母人造染色体的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI连接转化酵母菌重组酵母染色体具有较高的外源DNA的载装能力*1、如果外源DNA与载体DNA均用同一种限制酶切开，则连接产物可能存在多种形式，如重组分子（我们所需要的）、自我连接的载体分子（称为载体的自我环化或空载），载体分子之间、外源DNA片段之间也会发生连接。注意：外源DNA片段在重组分子中可能存在正反两种方向。2、如果外源DNA与载体DNA均经两种非同尾酶处理后连接，则只有一种方向。（识别位点不同，但切割出相同的末端序列）*Supercoiled?(or?Covalently?Closed-Circular)?DNA?is?fully?intact?with?both?strands?uncut,?and?with?a?twist?built?in,?resulting?in?a?compact?form,?so?they?move?faster?others.Linear?DNA?has?free?ends,?it?moves?at?the?speed?similar?to?its?molecular?weight,?compared?to?the?markers.Nicked?Open-Circular?DNA?has?one?strand?cut,?it?is?not?supercoiled,?and?it?is?not?compact?form,?b