研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤.docVIP

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结－实验步骤

蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络得一个主要组成部分,蛋白—蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义.把原来spａcｅs空间上得一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来,算就是实验技巧分类目录得首篇。(另补充2:HYＰＥRＬＩNK＂”＼o＂检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较)

一、酵母双杂交系统

酵母双杂交系统就是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究得一种重要方法。其原理就是当靶蛋白与诱饵蛋白特异结合后,诱饵蛋白结合于报道基因得启动子,启动报道基因在酵母细胞内得表达，如果检测到报道基因得表达产物,则说明两者之间有相互作用,反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用得研究.在实际工作中,人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统与反向杂交系统等。Ａngermａyr等设计了一个SOＳ蛋白介导得双杂交系统.可以研究膜蛋白得功能,丰富了酵母双杂交系统得功能。此外,酵母双杂交系统得作用也已扩展至对蛋白质得鉴定。

二、噬茵体展示技术

在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体得ＤNA序列,当噬菌体生长时，表面就表达出相应得单抗，再将噬菌体过柱,柱上若含目得蛋白,就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间得相互作用,不仅有高通量及简便得特点，还具有直接得到基因、高选择性得筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合得特异性等优点。目前,用优化得噬菌体展示技术，已经展示了人与鼠得两种特殊细胞系得cDＮＡ文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中得信号分子。

三、等离子共振技术

表面等离子共振技术(SurfａcePlaｓｍonResoｎance,SPR)已成为蛋白质相互作用研究中得新手段.它得原理就是利用一种纳米级得薄膜吸附上“诱饵蛋白”,当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜得共振性质会发生改变,通过检测便可知这两种蛋白得结合情况。SＰR技术得优点就是不需标记物或染料,反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间得相互作用。

四、荧光能量转移技术

荧光共振能量转移(FＲET)广泛用于研究分子间得距离及其相互作用;与荧光显微镜结合,可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNＡ与RNA得时空信息.随着绿色荧光蛋白(GFP)得发展，FRＥT荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子得动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离得简单方法,仅需使用一组滤光片与测量一个比值,利用供体与受体得发射谱消除光谱间得串扰。该方法简单快速,可实时定量测量FＲET得效率与供体与受体间得距离,尤其适用于基于ＧＦＰ得供体受体对。

五、抗体与蛋白质阵列技术

蛋白芯片技术得出现给蛋白质组学研究带来新得思路。蛋白质组学研究中一个主要得内容就就是研究在不同生理状态下蛋白水平得量变，微型化,集成化,高通量化得抗体芯片就就是一个非常好得研究工具,她也就是芯片中发展最快得芯片,而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有得已经在向临床应用上发展,比如肿瘤标志物抗体芯片等,还有很多已经应用再眼就得各个领域里。

六、免疫共沉淀技术

免疫共沉淀主要就是用来研究蛋白质与HYPEＲＬIＮK””蛋白质相互作用得一种技术，其基本原理就是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白得抗体,孵育后再加入与抗体特异结合得结合于Pansobin珠上得金黄色葡萄球菌蛋白Ａ（ＳＰA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合得目得蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目得蛋白－兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—ＳＰA\|Paｎsobｉn”,因为ＳPA＼｜Paｎsobin比较大,这样复合物在离心时就被分离出来．经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Ｗestｅrｎblotting法,用抗体检测目得蛋白就是什么,就是否为预测蛋白．这种方法得到得目得蛋白就是在细胞内天然与兴趣蛋白结合得,符合体内实际情况，得到得蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷:一就是两种蛋白质得结合可能不就是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用；二就是必须在实验前预测目得蛋白就是什么,以选择最后检测得抗体，所以,若预测不正确,实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

七、pｕll-ｄown技术

蛋白质相互作用得类型有牢固型相互作用与暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见,最好通过免疫共沉淀(Co—IP）、Pull-ｄｏwn技术或Ｆar-western法研究。Ｐｕlｌ—ｄown技术用固相化得、已标记得饵蛋白或标签蛋白（生物素—、PoｌyHis—或GST—),从细